番茄SlSUVH1基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法

本发明涉及基因工程，特别是涉及一种番茄slsuvh1基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法。

背景技术：

1、番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus，tylcv)属于双生病毒科，菜豆金色花叶病毒属，是目前研究最多的植物病毒之一，同时也是对全球番茄生产危害最大的病毒。流行时可造成农作物的产量和品质下降，对农业经济造成严重损失。

2、tylcv在自然界中主要通过烟粉虱进行传播，传播tylcv的烟粉虱主要有b型和q型，并且q型烟粉虱的传毒效率比b型高。除了介体传播外，tylcv可以通过嫁接传播。tylcv侵染植物后会使植物生长缓慢，造成植株矮化，还会使叶片卷曲、黄化和皱缩。

3、利用抗病基因防控双生病毒是农业生产中有效、绿色的病毒病害防控方法。然而，由于目前生产上可用的商业化品种具有的抗性基因有限，同时田间病毒的复合侵染会导致抗病基因介导的抗性损失。通过利用隐性抗病基因(也叫绿色抗病突变体)：即该基因在病毒侵染中具有重要功能，敲除或者缺失该基因会严重抑制病毒的复制、转录、翻译或移动等病毒的必要生命过程，但是该基因的敲除或者缺失不会影响植物的生长、发育与繁殖。由于隐性抗病基因介导的抗性具有重要的应用价值，因此利用该类基因传递对病毒的抗性具有重要意义。

4、本发明通过前期研究发现slsuvh1基因能够促进双生病毒的侵染，因此通过利用这个基因，构建和培育其绿色突变体，可实现对双生病毒的有效防控。

技术实现思路

1、本发明的第一目的是提供一种番茄slsuvh1基因在调控植物抗病毒中的应用。

2、本发明的第二目的是提供一种番茄slsuvh1基因敲除的转基因植物的培育方法。

3、本发明发现了番茄中slsuvh1基因是一个感病基因。通过农杆菌转化的方法，将携带slsuvh1靶点的crispr载体导入目的植物中，获得的番茄slsuvh1基因敲除植物能够显著减轻tylcv的侵染，有效控制该病毒的危害。

4、具体而言，本发明采用的技术方案具体如下：

5、番茄slsuvh1基因在调控植物抗病毒中的应用，其中，所述病毒为番茄黄化曲叶病毒tylcv。所述slsuvh1基因的转录本序列如seq id no:1所示，所述植物为番茄。

6、具体的，通过构建番茄基因slsuvh1敲除载体，即：针对番茄slsuvh1基因编码区具备pam位点设计相应的特异性靶向sgrna，构建到骨架载体bkg质粒上；以无菌培养的番茄叶片做愈伤组织，使用农杆菌介导的t-dna方式进行遗传转化，将敲除载体导入目的植物中，获得的番茄slsuvh1基因突变的纯合植物能够显著减轻番茄黄化曲叶病毒的侵染。

7、一种抗番茄黄化曲叶病毒的slsuvh1转基因植物的培育方法：通过叶盘法，将携带slsuvh1基因靶点的基因敲除载体导入目的植物中，获得番茄slsuvh1基因突变的纯合植物。

8、具体包括以下步骤：

9、(1)分别对slsuvh1两个拷贝基因公共保守区域进行crispr靶点筛选，得到grna靶点序列，如seq id no:2所示；设计引物进行pcr扩增，克隆得到slsuvh1-grna-grna片段；引物为slsuvh1-grna-f和slsuvh1-grna-r，序列分别如seq id no:3-4所示；

10、(2)将slsuvh1-grna-grna构建到带有crispr-cas9载体上，获得重组质粒；

11、(3)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500v电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有crispr-cas9重组质粒的农杆菌；

12、(4)将带有重组质粒的农杆菌侵染番茄叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；

13、(5)小苗生长稳定后，取叶片样品，使用ctab法抽提dna；利用引物对m13-f与bkg-grna-r，以提取dna为模板进行pcr扩增，确定植物中转入了外源crispr-cas9序列；所述m13-f和bkg-grna-r的序列如seq id no:5-6所示；

14、(6)在阳性转基因材料上，使用引物bkg-slsuvh1-f与bkg-slsuvh1-r克隆番茄slsuvh1基因靶点序列，通过测序，筛选两个拷贝基因均被编辑的株系，留种；所述bkg-slsuvh1-f、bkg-slsuvh1-r的序列如seq id no:7-8所示；

15、(7)在得到的t1代种子中筛选纯合编辑株系，并在纯合株系中选择剔除crispr-cas9骨架的植物进行收种，获得slsuvh1基因敲除番茄。

16、同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

17、本发明发现了番茄中slsuvh1基因是感病基因，并克隆了该基因，并且通过农杆菌转化的方法，将携带slsuvh1靶点的crispr载体导入目的植物中，获得了转基因剔除的slsuvh1基因敲除番茄。获得的slsuvh1基因敲除植物能够显著减轻番茄黄化曲叶病毒的侵染，抑制番茄黄化曲叶病毒造成的病害。

18、下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的番茄slsuvh1基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法作进一步说明。

技术特征：

1.番茄slsuvh1基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述病毒为番茄黄化曲叶病毒；所述slsuvh1基因的转录本序列如seq id no:1所示。

2.根据权利要求1所述番茄slsuvh1基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述植物为番茄。

3.根据权利要求2所述番茄slsuvh1基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：采用农杆菌介导的t-dna方式进行遗传转化，将基因敲除载体导入目的植物中，获得的番茄slsuvh1敲除植株能够显著减轻番茄黄化曲叶病毒的侵染。

4.一种抗番茄黄化曲叶病毒的slsuvh1转基因植物的培育方法，其特征在于：使用农杆菌介导的t-dna方式进行遗传转化，将基因敲除载体导入目的植物中，获得的番茄slsuvh1敲除植株，所述slsuvh1基因的转录本序列如seq id no:1所示。

5.根据权利要求4所述的slsuvh1转基因植物的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的slsuvh1转基因植物的培育方法，其特征在于：所述步骤(1)中的引物为slsuvh1-grna-f和slsuvh1-grna-r，序列分别如seq id no:3-4所示。

7.根据权利要求6所述的slsuvh1转基因植物的培育方法，其特征在于：所述m13-f和bkg-grna-r的序列如seq id no:5-6所示。

8.根据权利要求7所述的slsuvh1转基因植物的培育方法，其特征在于：所述bkg-slsuvh1-f、bkg-slsuvh1-r的序列如seq id no:7-8所示。

技术总结
本发明公开了一种番茄SlSUVH1基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法，所述病毒为番茄黄化曲叶病毒，SlSUVH1基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过农杆菌转化的方法，将携带目的基因靶点的基因敲除载体导入目的植物中，获得了番茄SlSUVH1基因敲除植物，获得的番茄SlSUVH1敲除植物能够显著减轻番茄黄化曲叶病毒的侵染。

技术研发人员：李方方,周雪平,刘贺,龚攀
受保护的技术使用者：中国农业科学院植物保护研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16