一种适配体传感器、靶标物的识别方法及应用

本申请涉及生物检测领域，特别涉及一种适配体传感器、靶标物的识别方法及应用。

背景技术：

1、近年来，成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats,crispr)系统以其操作简单、携带方便、特异性高等优点，在分子诊断领域得到了广泛的发展和应用。已有多种cas蛋白，如cas12a和cas13a，被用于生物传感器中，并通过顺式和反式切割活性实现了特异性识别和信号放大。crispr rna(crrna)与靶标dna结合后，cas12a被激活，使靶标双链dna(dsdna)的位点特异性断裂，并能对环境中游离的单链dna(ssdna)进行非特异性切割。同样，cas13a识别单链rna(ssrna)并切割靶标序列和游离的ssrna。然而，由于crispr系统无法直接识别蛋白质或小分子，因此依赖信号转导策略来建立连接。chen等人提出了一种新的基于crispr/cas13a的信号放大-免疫吸附测定法，用于超低浓度的蛋白质检测。该方法将抗原-抗体相互作用作为信号转导机制。在酶联免疫吸附测定(elisa)中使用含有t7启动子的生物素化dsdna代替酶，使免疫结合转化为cas13a-crrna的识别和激活。值得注意的是，该方法具有极高的灵敏度，比传统elisa高出100倍。

2、除了抗原-抗体反应外，还有一些生物识别元件，如适配体和dna酶，可以与crispr/cas结合，用于非核酸靶标的检测。适配体是一种稳定的dna或rna分子，它们对靶标具有高度亲和力和高特异性，能够将靶标的识别转化为信号的输出。适配体具有稳定性好、制备成本低、靶标范围广等优点。值得注意的是，适配体在生物传感中的应用有效地克服了基于crispr的免疫分析的局限性，包括复杂的信号转导和体系异构等限制。适配体传感器通常使用部分或完全互补的locker dna序列来阻断非特异性识别，在靶标和适配体复合物特异性识别时释放locker dna，并产生可检测的信号。较长的locker dna序列难以释放，导致特异性信号较低，而过短的locker dna序列不能有效地阻断非特异性结合并启动后续步骤。

3、因此，要达到较高的信噪比需要仔细筛选locker dna的序列长度。目前，已经开发了多种策略来应对这一挑战，通常采用序列长度为11nt的最小locker dna。然而，这一长度仍限制了适配体传感器对各种弱亲和力靶标物的检测性能。

技术实现思路

1、鉴于此，有必要针对现有适配体传感器对各种弱亲和力靶标物的检测性能受限的技术缺陷的提供一种简便性和通用性较佳的适配体传感器、靶标物的识别方法及应用。

2、为解决上述问题，本申请采用下述技术方案：

3、本申请目的之一，提供一种适配体传感器，包括由一段由适配体序列、locker dna和crrna识别序列组成的一段长的单链dna，所述适配体序列、locker dna和crrna中各组分互补杂交形成发夹结构。

4、在其中一些实施例中，所述locker dna和所述适配体序列之间的杂交序列长度可调整。

5、在其中一些实施例中，所述locker dna的长度为7nt或4nt。

6、本申请目的之一，提供了一种靶标物的识别方法，包括下述步骤：

7、将靶标物加入到权利要求1所述的适配体传感器的溶液中，并在25～37℃下孵育0.5～1h；然后加入t4 dna聚合酶，并将混合物在10～25℃孵育5～20min，以产生延伸的互补链；然后加入cas12a/crrna和f-ssdna-q探针，并使其在25～37℃条件下反应30～120min；使用荧光分光光度计收集荧光数据。

8、在其中一些实施例中，所述靶标物包括s蛋白和三磷酸腺苷。

9、在其中一些实施例中，所述t4dna聚合酶的浓度为3u，孵育时间为10min，cas12a和crrna的浓度分别50nm和100nm。

10、本申请目的之三，提供了一种所述的适配体传感器在识别靶标物中的应用。

11、本申请采用上述技术方案，其有益效果如下：

12、本申请提供的适配体传感器、靶标物的识别方法及应用，包括一段由适配体序列、locker dna和crrna识别序列组成的一段长的单链dna，各组分互补杂交形成发夹结构。通过t4聚合酶的聚合作用使茎环延伸，将crrna识别序列转化为完整的双链dna，从而激活cas12a的反式切割活性并产生荧光信号。靶标物和适配体之间的特异性结合阻碍了发夹结构的形成并使荧光信号发生变化，本申请提供的适配体传感器无需调整crrna，消除了蛋白质/小分子检测中常见的多相反应和输出信号的复杂转导等问题，只要简单地改变适配体序列和locker dna即可实现编程，可以实现对不同靶标物的检测，大幅提高信噪比并拓宽检测范围。

技术特征：

1.一种适配体传感器，其特征在于，包括由一段由适配体序列、locker dna和crrna识别序列组成的一段长的单链dna，所述适配体序列、locker dna和crrna中各组分互补杂交形成发夹结构。

2.如权利要求1所述的适配体传感器，其特征在于，所述locker dna和所述适配体序列之间的杂交序列长度可调整。

3.如权利要求2所述的适配体传感器，其特征在于，所述locker dna的长度为7nt或4nt。

4.一种靶标物的识别方法，其特征在于，包括下述步骤：

5.如权利要求4所述的靶标物的识别方法，其特征在于，所述靶标物包括s蛋白和三磷酸腺苷。

6.如权利要求4所述的靶标物的识别方法，其特征在于，所述t4 dna聚合酶的浓度为3u，孵育时间为10min，cas12a和crrna的浓度分别50nm和100nm。

7.一种如权利要求1所述的适配体传感器在识别靶标物中的应用。

技术总结
本申请提供的适配体传感器、靶标物的识别方法及应用，包括一段由适配体序列、locker DNA和crRNA识别序列组成的一段长的单链DNA，各组分互补杂交形成发夹结构。通过T4聚合酶的聚合作用使茎环延伸，将crRNA识别序列转化为完整的双链DNA，从而激活Cas12a的反式切割活性并产生荧光信号。靶标物和适配体之间的特异性结合阻碍了发夹结构的形成并使荧光信号发生变化，本申请提供的适配体传感器无需调整crRNA，消除了蛋白质/小分子检测中常见的多相反应和输出信号的复杂转导等问题，只要简单地改变适配体序列和locker DNA即可实现编程，可以实现对不同靶标物的检测，大幅提高信噪比并拓宽检测范围。

技术研发人员：马英新,毛国斌,戴俊彪
受保护的技术使用者：中国科学院深圳先进技术研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15