一种整合型HIV-1DNA实时荧光定量检测引物探针组及应用的制作方法

本发明涉及一种整合型hiv-1 dna实时荧光定量检测引物探针组及应用，属于生物医学检测。

背景技术：

1、艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征(aids)，其病原体为人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)。hiv属于反转录病毒科慢病毒属中的人类慢病毒组，为直径100～120nm的球形颗粒。hiv基因组全长约9.7kb，分为hiv-1型和hiv-2型，我国以hiv-1为主要流行株。hiv进入细胞核内，在整合酶的作用下整合到宿主细胞的染色体dna中。这种整合到宿主dna中的病毒dna即被称为“前病毒”。携带hiv前病毒的非art靶向静息记忆cd4+t细胞不被免疫系统识别，并在体内持续存在，这是根除hiv的主要障碍。未整合的dna仅在低水平转录，对生产性hiv感染的贡献很小。因此，整合的hiv dna的准确定量对于评估旨在功能性治愈的治疗策略至关重要。

2、巢式pcr是一种变异的聚合酶链反应(pcr)，使用两对pcr引物扩增完整的片段。第一对pcr引物扩增片段和普通pcr相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次pcr扩增片段的内部)结合在第一次pcr产物内部，使得第二次pcr扩增片段短于第一次扩增。alu-pcr技术是1989年由nelson等人首先提出的，它利用人类dna中普遍存在的alu重复序列作为引物，此技术较一般pcr反应的区别就在于它引物设计利用了人类的alu家族。green是一种插入dna分子的染料，具有多种分子生物学应用，其中之一就是用于实时定量pcr(qpcr)。随着pcr循环的连续进行，这种染料的荧光强度会不断增强，从而可以使人们对反应中的dna进行定量。sybr green法及一些其他基于染料的qpcr方法比探针法的成本低，使用也更为方便。不过这些方法也存在着与生俱来的弊端，sybr green方法产生的非特异性产物较多，会导致高背景和假阳性；使用较为广泛的taqman探针法，较sybr法相比对目标序列具有更高的特异性。pcr技术的发明与改进极大地促进了分子诊断技术的发展，对于大多数常见疾病均有采用pcr技术进行检测的报导。因此，针对整合型hiv dna的pcr检测技术不仅能够为hiv感染的临床诊断提供辅助作用，也能够在hiv功能性治愈的临床诊疗方案提供一定的指导依据。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是：如何准确定量检测整合的hiv dna的技术问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明采取了以下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种整合型hiv-1 dna实时荧光定量检测引物探针组，所述引物探针组(是根据alu元件及hiv-1hxb2株基因组序列设计的)包括：

4、β-actin qpcr引物探针组：引物序列如seq id no：1～2所示，探针序列如seq idno：3所示；

5、alu-gag pcr引物组：序列如seq id no：4～5所示；

6、ltr qpcr引物探针组：引物序列如seq id no：6～7所示，探针序列如seq id no：8所示；

7、其中，所述探针为taqman荧光探针，其5’末端携带有荧光基团，3’端携带有淬灭基团。

8、本发明的第二方面，提供上述技术方案中的引物探针组在制备定量检测整合型hiv-1 dna的试剂盒中的应用。

9、本发明的第三方面，提供一种定量检测整合型hiv-1 dna的试剂盒，所述试剂盒中包括上述技术方案中的引物探针组。

10、本发明的第四方面，提供一种整合型hiv-1 dna实时荧光定量检测方法，该方法应用上述技术方案中的引物探针组或上述技术方案中的试剂盒进行检测，包括以下步骤：

11、步骤1：提取来源于待测hiv感染者样本中的病毒核酸；

12、步骤2：通过β-actin pcr反应进行细胞数量测定；

13、步骤3：通过alu-gag pcr和ltr-qpcr扩增反应，得到样本中整合型hiv dna ct值；

14、步骤4：将步骤3通过两步pcr反应得到的循环阈值(ct值)代入标准曲线，从而计算得到样本中整合型hiv-1 dna拷贝数。

15、优选地，所述标准曲线是采用已知拷贝数的hiv-1标准品稀释液通过所述步骤1～4，收集得到量化的标准品dna拷贝数量以及循环阈值(ct值)数据，根据收集的数据进行线性拟合，从而拟合得到的以ct值为纵坐标，整合型hiv dna拷贝数为横坐标的标准曲线。

16、优选地，所述样本为待测hiv感染者的pbmc(peripheral blood mononuclearcell，外周血单个核细胞)或全血。

17、本发明的第五方面，提供上述技术方案中的方法在筛选治疗hiv的药物中的应用

18、alu-gag pcr利用灵长类基因组dna中的重复元件alu与hiv-1 ltr区整合之间的线性关系来扩增、计算和推导整合的hiv-1 dna的病毒载量。本发明基于alu-gag pcr定量检测整合型hiv-1 dna，该方法是一种基于pcr技术的整合型hiv-1 dna定量检测方法(图1)。该方法利用人基因组dna与hiv-1 ltr区整合之间的线性关系来扩增、计算和推导整合的hiv-1 dna的病毒载量，该方法通过设计引物来区分整合的dna和未整合的dna，使用一个匹配alu序列的上游引物和另一个匹配hiv-1gag序列的下游引物进行第一次pcr。该引物仅允许hiv-1 dna在整合时进行指数扩增。alu是人类基因组中的重复元素，大约每5000个碱基对发生一次。gag是一种hiv-1基因，编码病毒粒子的结构成分。第二次pcr通过使用hiv-1长末端重复序列(ltr)内的引物来检测hiv-1特异性产物。该检测方法具有pcr检测的灵敏度和稳定性。同时，该方法不要体外培养、对于实验室安全等级要求低，安全性高，操作简洁、劳动强度低，因此较为适合临床使用。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

20、本发明提供的一种整合型hiv-1 dna实时荧光定量检测引物探针组及应用，是基于alu-gag-pcr技术，根据alu元件及hiv-1hxb2株基因组序列设计的，基于所述引物探针组设计的检测方法具有pcr检测的灵敏度和稳定性，同时，该方法不要体外培养、对于实验室安全等级要求低，安全性高，操作简洁、劳动强度低，因此较为适合临床使用；与其他方法相比，alu-gag pcr具有最低的劳动强度和耗时，因此更适合临床使用，主要用于评估药物是否可以降低hiv dna整合率。

技术特征：

1.一种整合型hiv-1dna实时荧光定量检测引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括：

2.权利要求1所述的引物探针组在制备定量检测整合型hiv-1dna的试剂盒中的应用。

3.一种定量检测整合型hiv-1dna的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述的引物探针组。

4.一种整合型hiv-1dna实时荧光定量检测方法，其特征在于，该方法应用权利要求1所述的引物探针组或权利要求3所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述标准曲线是采用已知拷贝数的hiv-1标准品稀释液通过所述步骤1～4，收集得到量化的标准品dna拷贝数量以及循环阈值(ct值)数据，根据收集的数据进行线性拟合，从而拟合得到的以ct值为纵坐标，整合型hiv dna拷贝数为横坐标的标准曲线。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述样本为待测hiv感染者的pbmc(peripheral blood mononuclear cell，外周血单个核细胞)或全血。

7.权利要求4所述的方法在筛选治疗hiv的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种整合型HIV‑1DNA实时荧光定量检测引物探针组及应用。本发明的引物探针组是根据Alu元件及HIV‑1HXB2株基因组序列设计的，其包括：β‑actin qPCR引物探针组：引物序列如SEQ ID NO：1～2所示，探针序列如SEQ ID NO：3所示；Alu‑gag PCR引物组：序列如SEQ ID NO：4～5所示；和LTR qPCR引物探针组：引物序列如SEQ ID NO：6～7所示，探针序列如SEQ ID NO：8所示。根据该引物探针组设计的Alu‑gag PCR检测方法具有最低的劳动强度和耗时，因此更适合临床使用，可用于评估药物是否可以降低HIV DNA整合率。

技术研发人员：张欣宇,陈军,沈银忠
受保护的技术使用者：上海市公共卫生临床中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16