一种提高19-去甲睾酮纳米抗体表达量及灵敏度的方法

本发明属于食品安全检测。更具体地，涉及一种提高19-去甲睾酮纳米抗体表达量及灵敏度的方法。

背景技术：

1、苯丙酸诺龙是动物源性动物常用的类固醇激素之一，广泛用于畜牧业中以促进蛋白质的合成、减少脂肪堆积、提高饲料报酬。但苯丙酸诺龙的滥用及残留会造成食品安全问题，因此，需要加强对食品中苯丙酸诺龙的检测。目前主要是以其次生代谢物19-去甲睾酮(19-nortestosterone，19-nt)作为苯丙酸诺龙残留检测的标志物，而对于19-去甲睾酮的检测常采用色谱法、质谱法、免疫分析法；而免疫分析法中，采用抗体进行检测具有快速、简便、灵敏度高等优点，近年来已成为食品安全检测常用手段，而核心试剂抗体的制备是免疫检测技术的关键。

2、纳米抗体(nanobody，nb)是驼科动物中轻链天然缺失、只有重链可变区的新型抗体分子，具有分子量小、可溶性好、稳定性高及易表达等优势，在免疫检测方面具有极大的应用潜力。中国专利cn111269320a公开了一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体nt8能够用于用19-去甲睾酮的检测，但其纳米抗体的表达量不高，灵敏度仍有待提高，限制了抗19-去甲睾酮纳米抗体的应用。

3、包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒。包涵体的新创：大肠杆菌没有哺乳动物细胞中携带的蛋白质翻译后修饰的细胞器及功能酶，导致中间体大量堆积，容易发生链间二硫键错配，加重包涵体的生成；包涵体的生成与蛋白本身的性质也有很大的关系，一般蛋白链内含多个半胱氨酸这样的含硫残疾，更容易形成二硫键；环境也有很大的关系，细胞内部的电势、ph都有可能促进包涵体的生成，与蛋白质等电点接近的环境回促进包涵体的形成；目的蛋白本身的结构，目的蛋白本身的聚集度趋势，亲疏水性都与包涵体的形成有关；目的蛋白可能对菌是有害的，出于菌的自身保护基制，目的蛋白被以无活性的包涵体沉淀形式表达出来。

4、蛋白表达量高，合成速度快，越容易形成包涵体，但目前还鲜有研究通过增强包涵体的表达直接提升其活性蛋白表达量，因为包涵体的形成与包涵体的复性和纯化在生物、医药领域是非常重要的问题，同时也是一个很棘手的问题。一般包涵体中目的蛋白的含量高，约50％，可以高效的获得目的蛋白，但是只能先尿素或盐酸胍变性后重新复性才能恢复其生物活性，且活性水平一般都较差，所以包涵体的使用难度较大。如果从包涵体组分能高效的制备出高活性的蛋白，包涵体的使用无疑是有重要应用意义的。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有抗19-去甲睾酮纳米抗体nt8表达量不高，灵敏度较低以及包涵体无生物活性等问题，提供一种提高19-去甲睾酮纳米抗体表达量及灵敏度的方法。

2、本发明的目的是提供一种提高19-去甲睾酮纳米抗体表达量及灵敏度的方法。

3、本发明另一目的是提供一种高表达量、高灵敏度的抗19-去甲睾酮纳米抗体。

4、本发明又一目的是提供一种检测19-去甲睾酮的方法。

5、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

6、本发明提供一种提高19-去甲睾酮纳米抗体表达量及灵敏度的方法，包含如下步骤：

7、s1.将19-去甲睾酮纳米抗体融合硫氧还蛋白a构建表达载体，并转化至大肠杆菌表达宿主中进行诱导表达，得到菌体中的不溶组分即为纳米抗体包涵体表达组分；

8、s2.将纳米抗体包涵体表达组分通过一步法进行变性、复性、纯化和脱盐处理，即得高表达量及灵敏度的19-去甲睾酮纳米抗体。

9、进一步地，步骤s1中19-去甲睾酮纳米抗体为纳米抗体nt8，其氨基酸序列如seqid no.1所示。

10、本发明提供的方法能显著提高19-去甲睾酮纳米抗体表达量及灵敏度，通过将纳米抗体nt8融合硫氧还蛋白a(trxa)，构建重组表达载体pet-32a-nbnt8，通过优化大肠杆菌表达宿主，诱导剂浓度，诱导温度最终得到纳米抗体包涵体表达量最高的表达体系；并同优化纳米抗体包涵体变性工作液的配方，建立纳米抗体包涵体一步法进行柱上复性、纯化及脱盐，最终制备的纳米抗体trxa-nbnt8表达量可达65mg/l培养基。包涵体是没有活性的目的蛋白固体，优化包涵体变性缓冲液、包涵体复性缓冲液的配方，可以提高包涵体的提取效率及复性后蛋白的活性水平。同时，本发明建立的ic-elisa方法检测19-去甲睾酮，采用纳米抗体trxa-nbnt8的检测限低至0.877pg/ml，线性范围为3.71-514.09pg/ml，灵敏度43.67pg/ml。比原始pcomb3xss载体周质空间表达的纳米抗体nt8灵敏度(1.53ng/ml)提高了35.04倍。

11、进一步地，步骤s1中采用携带强启动子t7lac的pet-32a表达载体，可以经乳糖类似物iptg诱导高效率的启动乳糖操纵子，诱导目的蛋白快速表达；所述载体利用基因工程技术易于克隆、非常适合用于构建表达载体。

12、进一步地，步骤s1中大肠杆菌表达宿主为bl21de3、overexpress c43(de3)、rosetta de3、rosetta gamib de3或top 10f’。

13、优选地，大肠杆菌(e.coli)表达宿主采用bl21de3，将构建的pet-32a-trxa-nbnt8于e.coli bl21de3中构建表达工程菌。

14、进一步地，步骤s1中诱导表达条件为：在0.125～1mm iptg，20～37℃条件下诱导表达10～12h。

15、优选地，中诱导表达条件为：在1mm iptg，25℃条件下诱导表达12h。

16、进一步地，步骤s2中一步法为通过在柱上一步进行包涵体复性+纯化+脱盐，纯化采用akta pure和ni sepharose 6fast flow纯化仪器和材料进行。

17、进一步地，步骤s2中变性采用含20mm tris-hcl，0.5m nacl，6m盐酸胍，5mm咪唑，1mmβ-巯基乙醇，ph 8.0的变性缓冲液进行处理；然后采用含20mm tris，0.5m nacl，6m尿素，20mm咪唑，1mmβ-巯基乙醇，ph 8.0的包涵体变性增强液进行二次变性处理。

18、优选地，将不溶组分经包涵体洗涤液(20mm tris，0.5m尿素，0.5m nacl，2％tween-20，ph 8.0)室温洗涤5min后二次离心收集沉淀，采用包涵体变性缓冲液室温重悬包涵体，振荡30min，离心收集上清；采用akta pure、ni sepharose 6fast flow和脱盐柱实现复性、纯化和脱盐处理，先换用包涵体变性缓冲液进行柱平衡，恒定流速0.5ml/min上样，随后将流动相切换为包涵体变性增强液，流速1ml/min。

19、进一步地，步骤s2中复性采用含20mm tris，0.5m nacl，20mm咪唑，1mmβ-巯基乙醇，0.3m精氨酸，ph 8.0的包涵体复性缓冲液与包涵体变性增强液混合处理。

20、优选地，采用30cv的0％～100％的包涵体复性缓冲液进行柱上复性，流速0.5ml/min；叠用10cv 100％的包涵体复性缓冲液过柱，流速1ml/min。

21、更进一步地，步骤s2中洗脱采用包涵体洗脱缓冲液(20mm tris、300mm nacl、500mm咪唑、ph 7.4)洗脱目的蛋白，流速1ml/min；随后换用抗体储存液(10mm pbs，ph 7.4)进行脱盐柱柱平衡，流速2ml/min上样4ml。

22、作为一种最优的实施方案，本发明提供具体的方法：

23、s1.基于基因工程技术，构建重组表达载体pet-32a-nbnt8，将目的基因和载体pet-32a进行pcr扩增实现线性化，经过同源重组将片段与载体进行克隆构建；并转化至大肠杆菌表达宿主中进行诱导表达，采用bl21de3，在1mm iptg，25℃下诱导12h，收集菌体，经高压破碎提取包涵体沉淀，得到菌体中的不溶组分即为纳米抗体包涵体表达组分；

24、s2.诱导表达后菌体中的不溶组分(包涵体)采用包涵体洗涤液(20mm tris，0.5m尿素，0.5m nacl，2％ tween-20，ph 8.0)洗涤5min后重新离心去除上清。二次离心获得的沉淀采用包涵体变性缓冲液(20mm tris-hcl、0.5m nacl、6m盐酸胍、5mm咪唑、1mmβ-巯基乙醇、ph 8.0)重悬30min后离心收集上清，得包涵体变性上清；

25、s3.将上述s2得到的包涵体变性上清使用akta pure层析系统上样，目的蛋白与cytiva镍层析填料(ni sepharose 6fast flow)结合，使用包涵体变性增强液(20mm tris，0.5m nacl，6m尿素，20mm咪唑，1mmβ-巯基乙醇，ph8.0)，流速1ml/min，进行二次变性，洗去非特异性结合的杂质；

26、s4.柱上结合的目的蛋白trxa-nbnt8使用akta pure层析系统梯度将本发明的包涵体复性缓冲液(20mm tris，0.5m nacl，20mm咪唑，1mmβ-巯基乙醇，0.3m精氨酸，ph 8.0)与包涵体变性增强液混合，并梯度增加包涵体复性缓冲液的比例至100％，流速1ml/min，完成柱上复性；

27、s5.将完成复性的目的蛋白trxa-nbnt8从柱上洗脱，采用包涵体洗脱缓冲液(20mmtris、300mm nacl、500mm咪唑、ph 7.4)洗脱目的蛋白，流速1ml/min；洗脱后重新上样经脱盐柱置换到储存液(10mm pbs，ph 7.4)中，即得高表达量及灵敏度的19-去甲睾酮纳米抗体trxa-nbnt8。

28、本发明提供一种高表达量、高灵敏度的抗19-去甲睾酮纳米抗体，由上述方法处理得到。利用本发明方法处理后的抗19-去甲睾酮纳米抗体具有完整抗原识别能力地最小抗体片段(约15kda，trxa-nbnt8 36kda)；与传统抗体相比，本发明方法保持了纳米抗体的分子量小、有较高的表达量和稳定性、亲和力强、抗基质干扰能力强等优势。并且，本发明进一步提高了纳米抗体在大肠杆菌中的表达量，通过包涵体复性重组抗体提高了纳米抗体的灵敏度。

29、本发明还提供一种检测19-去甲睾酮的方法，采用高表达量、高灵敏度的抗19-去甲睾酮纳米抗体trxa-nbnt8进行检测。

30、优选地，所述检测进行间接竞争检测，采用包被原的包被浓度为0.25～1μg/ml。

31、更优选地，采用包被原的包被浓度为1μg/ml。

32、优选地，包被原采用19-去甲睾酮-ova(由19-去甲睾酮半抗原与卵清白蛋白(ova)通过活泼酯方法偶联得到)。

33、本发明具有以下有益效果：

34、本发明首次采用包涵体的形式表达纳米抗体，并通过一步法柱上复性、纯化、脱盐进行处理，为其提供了简便高效的制备方法，大大提高了纳米抗体的表达量。本发明方法的优势有：1)所制备的纳米抗体表达量高，成本低，灵敏度高；2)一步法柱上包涵体复性+纯化+脱盐操作简单，快速方便，适用于其他蛋白质；3)所制备的高质量抗19-去甲睾酮的纳米抗体用于建立ic-elisa方法，可用于食品中苯丙酸诺龙检测。

35、本发明不仅能显著提高纳米抗体trxa-nbnt8的表达量，提高6倍；同时明显提高纳米抗体的灵敏度，提高了35.04倍；并通过建立ic-elisa方法检测19-去甲睾酮，其检测限低至0.877pg/ml，灵敏度43.67pg/ml，检测范围为3.71-514.09pg/ml，为食品中苯丙酸诺龙的检测提供了高质量的识别元件，并有效降低了其生产成本。除此之外，本发明提供的方法适用于其他纳米抗体或其他蛋白质有效从包涵体中高效获得生物活性物质，为包涵体在原核表达系统的发展提供了参考。