一种靶向CD22的嵌合抗原受体及在相关疾病治疗中的应用的制作方法

本发明属于嵌合抗原受体，具体涉及一种靶向cd22的嵌合抗原受体、所述嵌合抗原受体修饰的t细胞及其在治疗b细胞恶性肿瘤、自身免疫疾病领域的应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)患儿的治愈率接近90％，成人b-all患者在接受多药联合方案治疗后存活率低于50％。尽管儿童和成人all治疗方面取得了很大进展，但仍有相当数量的患者治疗效果不佳，并且目前的标准治疗存在相当程度的短期和长期毒性。淋巴瘤是称为淋巴细胞的一类白细胞发生的恶性肿瘤。非霍奇金淋巴瘤较霍奇金淋巴瘤多见。在白血病中，大多数癌性白细胞位于血流和骨髓中。而在淋巴瘤中，大部分的恶性白细胞在淋巴结以及脾脏、肝脏等器官内。然而，白血病和非霍奇金淋巴瘤有时是重叠的，因为淋巴瘤患者可能会在血流中有癌性白细胞，而白血病患者的淋巴结和器官内也会出现癌细胞。基于单克隆抗体的治疗有望克服化疗耐药和治疗相关的潜在毒性，其中最有前景的是嵌合抗原受体修饰的t(car-t)细胞，它可以突破mhc限制性直接识别肿瘤抗原。

3、在不同诊疗中心，不同国家，使用不同结构car-t、淋巴细胞清除方案、自体或异体t细胞以及不同的cd19 car-t回输数量治疗难治复发的b-all患者，有50％～90％的患者可达到完全缓解。尽管如此，30-60％的患者治疗后复发。all有两种car治疗后复发模式，包括cd19阳性复发和cd19阴性复发。对于cd19阳性复发，其关键机制在于car-t细胞的持久性较差，cd19仍存在于b-all细胞表面，并可通过流式细胞术检测。对于cd19阴性复发，cd19的选择性剪接，移码突变和错义突变，导致肿瘤逃避car-t细胞介导的识别和清除，尽管car-t细胞持续存在。在cd19 car-t细胞治疗引起cd19抗原丢失后，cd22仍然保留。因此，可以通过选择新的靶点，进一步增强car-t细胞的抗肿瘤靶向潜力，提高治疗效果。

4、cd22与cd19一样是b系分化抗原，表达于b细胞发育的各个阶段，b细胞分化为浆细胞后不再表达cd22。60％～80％的b细胞恶性肿瘤表达cd22，几乎所有的前体b-all表达cd22；90％以上的弥漫大b细胞淋巴瘤(dlbcls)和滤泡淋巴瘤(fls)为cd22阳性；慢性淋巴细胞白血病(b-cll)、毛细胞白血病(hcl)也具有高水平的cd22表达。已有许多临床试验研究了靶向cd22的药物的有效性。例如，依他珠单抗(epratuzumab)是一种cd22单克隆抗体，在成人和儿童b-all中均具有一定的效果。更重要的是，与cd19抗原相似，cd22同样是b细胞限制性表达，不表达于其他实质细胞，亦不表达于造血干细胞，因此作为b细胞肿瘤抗原的特异性高，已经成为b细胞恶性肿瘤中的理想治疗靶点。

5、自身免疫病是由自身免疫失调所致，b细胞异常激活以及致病性自身抗体的生成是自身免疫病的重要特征之一。cd22是特异性表达于b淋巴细胞上的i型跨膜糖蛋白，为免疫蛋白超家族中唾液酸黏附素家族成员。目前靶向cd22的抗体药的临床适应症以自身免疫病为主，其作用机制是通过免疫调节抑制或清除异常b细胞，减少产生自身抗体，组织或缓解自身免疫病的发展。但抗体药对b细胞的清除能力有限且作用时间短，不像car-t细胞可以长期在体内生存。另外已有报道，cd19 car-t细胞用于治疗系统性红斑狼疮、重症肌无力等自身免疫病，完全缓解，未复发。与cd19抗原相似，cd22同样是b细胞限制性表达。因此，cd22 car-t对治疗自身免疫病具备一定的潜力。

技术实现思路

1、为了改善成人b-all、b-nhl等b细胞恶性肿瘤患者存活率低、多药联合治疗效果不佳的现状。本发明考虑从cd22在b细胞恶性肿瘤疾病中特异性高表达的特性入手，以cd22蛋白为靶点，提供一种嵌合抗原受体t细胞免疫治疗药物。

2、为了实现上述技术目的，本发明首先针对cd22中活性抗原区域进行筛选，制备cd22重组蛋白免疫羊驼，得到一种靶向cd22的纳米抗体，并进一步获得人源化纳米抗体。构建二代car质粒载体，通过分离t细胞，用编码car的慢病毒载体进行编程，从而获得一种表达靶向cd22的嵌合抗原受体(car)的t细胞。经验证，本发明提供的靶向cd22 car-t细胞能够有效刺激淋巴瘤细胞释放抗肿瘤免疫相关的关键细胞因子ifn-γ及il-2，促进癌细胞凋亡，激发免疫系统实现机体保护作用。并且在体内实验中，该靶向cd22 car-t细胞能够有效抑制小鼠体内移植瘤的生长，具有理想的特异性识别和清除cd22阳性肿瘤细胞的效果。

3、基于所取得的上述技术效果，本发明具体提供如下的技术方案：

4、本发明第一方面，提供一种靶向cd22的纳米抗体，所述纳米抗体的互补决定区序列如下：如seq id no：5所示的cdr1序列、seq id no:6所示的cdr2序列及seq id no：7所示的cdr3序列。

5、上述纳米抗体与人cd22的胞外段asp20-arg687(seq id no:1)具有良好的亲和性，能够发挥cd22靶向活性。

6、本发明的一种实施方式中，上述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no:3所示，由seq id no:1所示的抗原序列与igg1重链恒定区的fc段asp104-lys330结合免疫羊驼后分离得到，命名为b9-vhh。

7、实际生产过程中，为了获得更好的成药性，上述纳米抗体通常还需要进行优化，优化方式如人源化、二聚/多聚化或偶联其他功能基团，因此，在本发明的另外一些实施方式中，所述纳米抗体序列与seq id no:3所示的序列具有80％及以上的相似度，进一步，所述相似度为85％，90％，91％，94％或98％及以上，并且能够具有与b9-vhh基本一致的生理活性，所述相似度可通过blast工具实现。

8、上述靶向cd22的纳米抗体，其可行的应用领域如作为一种靶向功能基团用于药物制剂、指示剂等产品的开发，本发明提供的一种实施方式中，上述靶向cd22的纳米抗体应用于制备嵌合抗原受体。

9、本发明第二方面，提供一种嵌合抗原受体，至少包含抗原结合域、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述抗原结合域为权利要求1中的靶向cd22的纳米抗体。

10、所述跨膜结构域可以是来源于cd28、cd3、cd45、cd4、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137或cd154中的任意一种，本发明验证的实例中，采用述cd8跨膜结构域，其核苷酸序列如seq id no:16所示。

11、所述胞内结构域可以来源于cd3ζ、fcrγ、cd3γ、cd38、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、4-1bb或cd66b的细胞内结构域中的一种或几种；本发明验证的实例中，采用胞内信号传导结构域4-1bb(seq id no:17)以及cd3的胞内段cd3ξ(seq id no:18)组成。

12、一种实施方式中，上述嵌合抗原受体中还包括铰链区，用于连接抗原结合抗原结合域及跨膜结构域，可行的铰链区如igg1铰链区、cd8铰链区；本发明验证的实例中，为cd8铰链区，序列如seq id no:15所示。

13、又一种实施方式中，该嵌合抗原受体中还具有信号肽，所述信号肽的实例如cd8α，其序列如seq id no:14所示。

14、在嵌合抗原受体中，该抗原结合域优选采用人源化之后的纳米抗体，具体的实例中，上述b9-vhh的人源化抗体序列如seq id no:8(命名为b9-hm1)、seq id no:10(命名为b9-hm2)或seq id no:11(命名为b9-hm3)所示；因此，一个实例中，所述嵌合抗原受体命名为car02，由cd8α信号肽、b9-hm1、cd8铰链区、cd8跨膜区和胞内信号传导结构域4-1bb以及cd3的胞内段cd3ξ组成。

15、又一个实例中，所述嵌合抗原受体命名为car03，由cd8α信号肽、b9-hm2、cd8铰链区、cd8跨膜区和胞内信号传导结构域4-1bb以及cd3的胞内段cd3ξ组成。

16、又一个实例中，所述嵌合抗原受体命名为car04，由cd8α信号肽、b9-hm3、cd8铰链区、cd8跨膜区和胞内信号传导结构域4-1bb以及cd3的胞内段cd3ξ组成。

17、第三方面，提供编码上述嵌合抗原受体的核苷酸。

18、上述核苷酸应当适用于转导或转化细胞，优选的方案中，上述核苷酸应用能够与模块化组件连接并能够在宿主细胞中进行表达，所述宿主细胞的实例如t细胞，可行的表达方式如通过重组载体转染t细胞进行表达。

19、因此，本发明第四方面，提供一种重组载体，所述重组载体具有在t细胞中表达上述嵌合抗原受体的能力或包含第三方面所述的核苷酸。

20、所述重组载体优选为病毒载体，如通过γ-逆转录病毒或慢病毒方面转染t细胞，第三方面所示的核苷酸可能通过dna转座子、rna转染或基因组编辑技术(如talen、zfn和crispr/cas9)插入t细胞中。本发明验证的实施方式中，所述重组载体为慢病毒载体。

21、第五方面，提供一种t细胞，包含第二方面所述的嵌合抗原受体。

22、该方面所述的t细胞，本技术文件中也称car-t，该t细胞的类型可以为幼稚t细胞(t cells)、活化t细胞(activated t cells)、中央记忆t细胞(central memory tcells)或效应记忆t细胞(effector memory t cells)。由于上述t细胞应当是受试者自体来源的t细胞，优选从外周血、含有t细胞的细胞群中进行上述t细胞的分离。

23、第六方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中包括第五方面所述t细胞。

24、上述药物组合物中，所述t细胞应当是活性剂量，该活性剂量可依据t细胞的添加目的、t细胞类型、药物施用方式等进行常规调整，可行的药物施用方式如静脉注射、腹腔注射或定向注射至骨髓或淋巴结中。

25、除上述t细胞外，该药物组合物中还包括药学上可接受的载体或稀释剂，所述载体如冷冻保护剂(如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、甘露糖、乳糖、甘氨酸、精氨酸、亮氨酸或丝氨酸等)、表面活性剂(如聚山梨醇酯ps-20或ps-80)、抗氧化剂或稳定剂。

26、所示稀释剂可以为注射介质或等渗介质，如生理盐水、糖溶液、乳酸林格氏液或注射用脂肪乳。

27、第七方面，提供第一方面所述靶向cd22的纳米抗体、第二方面所述嵌合抗原受体、第五方面所述t细胞或第六方面所述药物组合物在制备cd22相关疾病治疗药物中的应用。

28、cd22限制性地表达于成熟b细胞和大多数恶性b淋巴瘤细胞表面，使其成为了自身免疫疾病和b细胞恶性肿瘤治疗的热门靶点之一；上述cd22相关疾病进一步为自身免疫性疾病或b细胞恶性肿瘤。cd22在大多数b细胞恶性肿瘤细胞表面都有高表达，具体实例如急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病。

29、同样的，作为b细胞限制性抗原，上述纳米抗体及嵌合抗原受体还可应用于自身免疫疾病，实例如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、原发性干燥综合征或系统性血管炎。

30、第八方面，提供一种肿瘤治疗方法，包括：获取患者的t细胞，对所述t细胞进行修饰，使其包含第二方面所述的嵌合抗原受体，并将修饰后的t细胞进行回输。