检测沙门氏菌的单价与二价单域重链抗体及其试剂盒

本发明涉及免疫分析化学，具体涉及一种检测沙门氏菌的单价与二价单域重链抗体及其试剂盒。

背景技术：

1、沙门氏菌(salmonella)是属于肠杆菌科中的一类无芽孢、需氧或兼性厌氧型的革兰氏阴性杆菌，目前发现，沙门氏菌属有2600多种血清型。其中，一部分血清型能够通过侵入、附着和绕过宿主肠道防御机制(胃酸、肠黏液、肠蠕动、乳铁蛋白和溶菌酶等)在宿主体内定殖，引发沙门氏菌病。由沙门氏菌引起的疾病是全世界最常报告的食源性疾病之一，采取有效措施对其进行快速检测和识别对于预防食源性疾病暴发和维护公共卫生安全具有深远意义。

2、常见的沙门氏菌检测方法主要有传统微生物培养法、分子生物学方法、免疫学检测方法等。其中，免疫学检测方法是基于抗原抗体特异性识别的特点对待测物进行检测分析，具有操作简便、准确可靠、灵敏度高、特异性强且适用于高通量检测等优势，已成为目前食源性致病菌常用的快速检测方法之一，是沙门氏菌快检领域不可或缺的重要手段。

3、目前针对沙门氏菌建立的免疫检测方法主要是以单克隆抗体或多克隆抗体作为识别元件，这两种抗体都是四肽链抗体，即都由四条异源性多肽链组成的对称的“y”型骨架结构，包含两条重链和两条轻链，分子量约为150kda。多克隆抗体制备流程简单，制备周期较短、成本低廉、应用较广，但是它作为免疫检测试剂仍具有缺陷，譬如从血清中收集纯化抗体得到的非特异性抗体比例较高，导致出现背景信号或交叉反应，不同批次抗体易产生批次间差异，供应有限，不适合大批量生产。单克隆抗体特异性较高、亲和力较好且能满足持续供应需求，但抗体稳定性较差，大量生产主要依靠动物，成本较高，同时，抗体亲和力主要由免疫原和免疫动物决定，再加上其分子量较大，无法实现体外亲和力成熟。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中沙门氏菌抗体制备困难、抗原亲和力差、稳定性差、批次差异大的问题，而且存在无法识别多种人畜共患血清型的缺陷，提供了一种检测沙门氏菌的单价与二价单域重链抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，vhh抗体)及其试剂盒，本发明通过vhh抗体文库构建淘选，提供了两条能够与沙门氏菌特异性结合的vhh抗体(vhh-i,vhh-ii)，并将二价化vhh-i作为捕获抗体，vhh-ii作为检测抗体，构建了双vhh检测试剂盒。该试剂盒具有操作简单、成本低廉、准确灵敏等优势，可用于食品样品中沙门氏菌多重血清型污染的快速检测。

2、为实现上述目的，本发明所设计的技术方案如下：

3、本发明提供了一种检测沙门氏菌的单价单域重链抗体，所述单价单域重链抗体(vhh抗体)为单价vhh-i抗体或单价vhh-ii抗体；其中，所述单价vhh-ii抗体的氨基酸序列为三条中任意一个，分别单价vhh-ii-1抗体、单价vhh-ii-2抗体和单价vhh-ii-3抗体，其中，

4、单价vhh-ii-1抗体的氨基酸序列如seq id no.1所示：

5、qlqlvesggglvqpggslrlscvtsgfnmdrytiawfrqragndlegvscisvnaghrvyadsvrgrftisrdntkktvylqmndlkpgdtavyycaapdpsyfqmtcgddlpaaffqvrgqgtqvtvss；

6、或单价vhh-ii-2抗体的氨基酸序列如seq id no.2所示：

7、qlqlvesggglvqpggslrlscvtsgfnmdrytiawfrqragndlegvscisvnaghrvyadsvrgrftisrdntkktvylqmndlkpedtavyycaapdpsyfqmtcgddlpaaffqvrgqgtqvtvsa；

8、或单价vhh-ii-3抗体的氨基酸序列如seq id no.3所示：

9、qvqlvesggglvqpggslrlscvtsgfnmdrytiawfrqragndlegvscisvnaghrvyadsvrgrftisrdntkktvylqmndlkpedtavyycaapdpsyfqmtcgddlpaaffqvrgqgtqvtvss；

10、所述单价vhh-i抗体的氨基酸序列如seq id no.4所示：

11、qvqlvesgggmaqageslrlscavagtsvsnlavswyrqapgkrrefvawilstgskdysnfvkgrftiskdsakntvylemsslkiedtgvyqcntvhlgnnywgqgtqvtvsa。

12、本发明还提供了一种检测沙门氏菌的二价单域重链抗体，所述二价单域重链抗体是以上述单价vhh-i抗体的核苷酸序列为基础，借助铰链区序列和柔性连接肽(gly4ser)2将两个单价vhh-i抗体的核苷酸序列串联合成后，表达纯化获得；其中，二价单域重链抗体(抗沙门氏菌二价divhh抗体，简称divhh)的氨基酸序列如seq id no.5所示：

13、qvqlvesgggmaqageslrlscavagtsvsnlavswyrqapgkrrefvawilstgskdysnfvkgrftiskdsakntvylemsslkiedtgvyqcntvhlgnnywgqgtqvtvsaepktpkpqdgqagqggggsggggsqvqlvesgggmaqageslrlscavagtsvsnlavswyrqapgkrrefvawilstgskdysnfvkgrftiskdsakntvylemsslkiedtgvyqcntvhlgnnywgqgtqvtvsaepktpkpqdgqagq。

14、进一步地，所述单价vhh-i抗体的核苷酸序列如seq id no.6所示：

15、caggtgcagctcgtggagtcggggggaggtatggcgcaggctggggaatctctgcgactctcctgtgcagtcgctggaaccagcgtcagtaatttggccgtgagctggtaccgccaggctccaggaaagcggcgcgagttcgtcgcatggattttgagtacggggagtaaagactattcaaacttcgtgaagggccgattcaccatctccaaagacagcgcaaagaacacggtgtatctggaaatgagtagcctgaaaattgaagatacaggcgtctatcaatgtaacacagtacatttgggaaataactattggggccaggggacccaggtcaccgtctccgca。

16、本发明还提供了一种检测沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括包埋有捕获抗体的酶标板和含有检测抗体的溶液；其中，

17、所述捕获抗体为上述二价单域重链抗体；

18、所述检测抗体为生物素标记的上述单价vhh-ii抗体。

19、进一步地，所述检测抗体是由上述单价vhh-ii抗体与生物素偶联而成，

20、再进一步地，所述包埋有捕获抗体的酶标板由以下步骤制备而成：将二价单域重链抗体(divhh)用pbs缓冲液稀释至10μg/ml，加入到空白酶标板中，4℃包被过夜，次日，用pbst(磷酸盐吐温缓冲液)洗涤酶标板，得到包埋有捕获抗体的酶标板。

21、再进一步地，所述试剂盒还包括：

22、a.灭活鼠伤寒沙门氏菌抗原标准液

23、b.多聚辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，即酶标二抗；

24、c.样品稀释液；

25、d.洗涤缓冲液；

26、e.显色a液；

27、f.显色b液；

28、g.2m的硫酸液。

29、再进一步地，所述样品稀释液(磷酸盐缓冲液)的配方为：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.9g、氯化钾0.2g，蒸馏水定容至1l；

30、所述洗涤缓冲液为含体积分数为0.05％tween-20的磷酸盐缓冲液，其配方为氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.9g、氯化钾0.2g、tween-20 0.5ml、蒸馏水定容至1l；

31、所述显色a液：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g na2hpo4·12h2o，tween-20 100μl，蒸馏水1000ml，ph 5.5；

32、所述显色b液：四甲基联苯胺(tmb)300mg(50ml dmso溶解)，10.3g柠檬酸，蒸馏水1000ml。

33、本发明还提供了一种利用上述试剂盒检测沙门氏菌的双vhhs抗体夹心免疫分析方法，包括以下步骤：

34、1)封闭：将包埋有捕获抗体的酶标板的每孔加入300μl 1％peg 20000，25℃孵育1h后弃液，用pbst洗板3次；

35、2)将待测沙门氏菌抗原水浴灭活后，加入酶标板中，在25℃下孵育反应1h，弃去反应液，pbst洗涤酶标板3次；

36、3)加入生物素标记单价vhh-ii检测抗体，25℃孵育1h。弃去反应液，pbst洗板3次；

37、4)加入多聚辣根过氧化物酶标记链霉亲和素于25℃孵育1h，用pbst洗板后，然后加入显色液(a液和b液混合，现用现配)，显色10min后加入2m的硫酸液终止反应；

38、5)用酶标仪于450nm波长测定酶标孔的od值，每个样品至少设置3个平行，绘制标准曲线，再计算得到待测样品中沙门氏菌的浓度。

39、本发明的原理：

40、基于检测沙门氏菌的双vhhs抗体免疫分析方法原理是：酶标板上的每个孔均封闭有相同量的抗沙门氏菌二价divhh抗体，用于捕获待测样品中的沙门氏菌血清型，并与之反应生成免疫复合物，洗涤后去除未结合的非沙门氏菌菌株，加入生物素标记单价vhh-ii抗体，形成夹心抗体—抗原—抗体复合物，再加入多聚辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，利用生物素和链霉亲和素之间的高度特异性，级联放大检测信号，最后用洗涤液洗涤后加入底物显色液：显色反应浅，用酶标仪检测的od值低，表明样品中沙门氏菌浓度低；反之，显色反应深，所测的od值高，样品中待测沙门氏菌浓度高。用已知浓度的灭活鼠伤寒沙门氏菌绘制标准曲线，可以准确计算出待测样品中沙门氏菌的浓度，实现定量检测。

41、本发明建立的双vhhs抗体免疫分析方法，是基于二价vhhs作为捕获抗体，单价vhh-ii作为检测抗体的双vhh抗体夹心检测方法。

42、本发明中制备得到的二价divhh抗体，氨基酸序列如seq id no.5所示，该序列在分析优化vhh-i单体序列的基础上，在基因层面借助柔性连接肽(gly4ser)2串联合成，具有良好的热稳定性、ph耐受能力和离子浓度稳定性，且扩宽了对沙门氏菌血清型的识别范围，在检测人畜共患沙门氏菌血清型污染方面表现出更大优势。通过在食品样品中添加不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌，经简单前处理后用所建立的免疫分析方法测定，对该方法进行验证。

43、本发明的有益效果：

44、1.检测食品环境中沙门氏菌的常规免疫分析方法的识别元件为单克隆抗体或多克隆抗体，普遍存在抗体制备成本高、稳定性差、操作难度大、批次间差异大等弊端。在驼科动物体内发现的一种天然缺失轻链和重链恒定区1(ch1)的重链抗体，克隆重链抗体可变区得到的vhh抗体，是具有完整抗原识别能力的最小抗原结合片段，具有稳定性强、水溶性好、易于基因工程改造等优势。

45、本发明筛选得到了抗沙门氏菌的单价与二价vhh抗体，该具有良好的热稳定性、ph耐受能力和离子浓度稳定性，可在多种原核和真核表达系统中快速大规模稳定生产，操作简单，将其应用于食品样品中沙门氏菌的免疫检测分析，具有广阔的应用前景。

46、2.经基因串联二价化改造后的二价divhh抗体，相较于改造前的单价vhh-i抗体，具有更宽泛的沙门氏菌血清型识别范围，将其作为所建立方法中的捕获抗体，能够实现引起人类食源性疾病感染和暴发的最常见的人畜共患沙门氏菌血清型的快速识别和检测，有助于预防和控制沙门氏菌的感染和暴发。

47、3.生物素标记单价vhh-ii抗体作为检测抗体，采用链霉亲和素和辣根过氧化物酶的偶联物作为酶标二抗，可以显著提高检测方法的灵敏度。采用二价divhh抗体作为捕获抗体，生物素标记单价vhh-ii抗体作为检测抗体所建立的免疫分析方法的最低检出限为1.04×102cfu/ml，采用本发明检测食品样品中的鼠伤寒沙门氏菌，加标回收率在83.30％-106.11％之间，变异系数(cv)均低于10％，能准确测定食品样品中沙门氏菌的含量。

48、4.本发明中所要保护的试剂盒中包括了二价divhh抗体、生物素标记单价vhh-ii抗体等试剂，能够满足食品样品中沙门氏菌的检测要求，是一种成本低廉、准确灵敏的沙门氏菌快速检测方法。

49、综上所述：本发明涉及括噬菌体展示vhh抗体文库的构建、特异性结合鼠伤寒沙门氏菌阳性噬菌体克隆的淘选、单体与二价vhh抗体的氨基酸序列、单价vhh-ii抗体与生物素的偶联、双vhhs抗体免疫分析方法的建立。

50、本发明首次通过基因串联方式、原核表达获得了纯度高、稳定性好的二价divhh抗体并作为捕获抗体检测食品样品中的沙门氏菌。这种方法扩宽了对沙门氏菌血清型的识别范围，更适合于对沙门氏菌常见人畜共患血清型污染的检测，极大地减少了免疫分析测定中普通抗体易失活、稳定性较差的因素。因此，该方法是一种高效准确灵敏的测定方法。