与HPV45型衣壳蛋白L1特异性结合的抗体或其抗原结合片段及其应用的制作方法

本发明涉及抗体，尤其是涉及一种与hpv45型衣壳蛋白l1特异性结合的抗体或其抗原结合片段及其应用。

背景技术：

1、人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，hpv)是一种无包膜的小dna病毒，目前约有200多种，hpv主要感染皮肤和粘膜组织，其中有40多种hpv感染可以导致人类疾病，根据hpv感染与癌症发生的关系，hpv可以分为高危型和低危型，其中hpv 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58及59等为高危型，高危型hpv持续性感染可引发宫颈癌、肛门癌和阴道癌等恶性肿瘤。其他的hpv亚型为低危型，主要引起皮肤黏膜的疣状增生，表现为尖锐湿疣、扁平疣等病变，目前在临床上还没有很好的治疗方法。

2、预防hpv感染最有效的方法是接种hpv疫苗，目前国内外已上市的5个宫颈癌疫苗均以hpv主要衣壳蛋白l1为有效抗原，通过基因重组技术在一定条件下组装为病毒样颗粒(virus-like particles，vlps)，再辅以不同的佐剂配制成疫苗。基于重组hpv l1 vlps疫苗的成功上市及广泛应用，充分表明了l1 vlps高度还原了天然hpv的结构，保留了天然病毒的关键中和表位，具有与野生同型病毒相同或相似的抗原性和免疫原性，可诱导高滴度的中和抗体，进而很好地预防hpv持续感染、宫颈癌、及其他相关疾病。目前已上市的hpv疫苗，merck公司的四价疫苗“gardasil”和九价疫苗“gardasil 9”以及国内外研制的超过两价次的hpv疫苗多数包含hpv 45型的疫苗成分。

3、在hpv疫苗生产的全程，保持正确的中和表位和稳定的vlps结构，是保证疫苗质量和有效性的前提。在疫苗生产工艺的各个环节建立准确、灵敏、特异的检测方法对抗原结构和定量进行全程监控既是技术的需要，也是法规的指导原则。利用经典的抗原抗体反应原理，采用中和抗体对抗原中和表位进行鉴定是疫苗质控的有效手段，通过western-blot、elisa、和ivrp等技术手段对hpv疫苗原液、半成品及成品中的抗原成分进行鉴别实验、抗原含量检测、抗原体外效力测定，可为疫苗的检测放行提供依据。因此单克隆中和抗体作为是疫苗抗原质控的重要反应试剂，并且同时具有特异性和中和活性的单克隆抗体在疫苗质控过程中具有不可替代的作用。另外，疫苗效力检测是疫苗成品放行的重要指标，目前hpv疫苗效力是通过疫苗免疫动物后采集血清，采用假病毒中和实验来检测血清的中和效价来进行评价，虽然该方法能够较好地反映疫苗成品的中和抗体水平，但也同时存在着动物用量较多，检测值波动较大，检测周期长，成本较高的缺点，同时也违背动物实验的3r原则，国内外一些企业已在响应国际组织的倡导，在逐渐淘汰动物实验检测疫苗成品效力的方法。目前已被认同和用于部分实践的，基于中和抗体针对疫苗抗原的中和表位和体外活性的质控和表征，已经是一种高效、经济、和可行的替代方法，例如美国默克公司的hpv疫苗，中国的甲肝和乙肝疫苗，都已经部分或全部使用中和抗体而非动物实验放行疫苗产品。因此，提供更多的能够结合hpv的中和性单克隆抗体是目前市场需要的。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种与hpv45型衣壳蛋白l1特异性结合的抗体或其抗原结合片段，通过以hpv45为抗原筛选获得单克隆抗体，通过克隆、鉴定与基因结构的分析，确定了其cdr区序列，本发明的另一目的是提供关于该抗体或其抗原结合片段的生物材料和它们的应用。

2、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

3、根据本发明一个方面，提供了一种与hpv45型衣壳蛋白l1特异性结合的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区；

4、所述重链可变区包含氨基酸序列如seq id no.1的vhcdr1，氨基酸序列如seq idno.2或3的vhcdr2，氨基酸序列如seq id no.4或5的vhcdr3；

5、所述轻链可变区包含氨基酸序列如seq id no.6的vlcdr1，氨基酸序列如seq idno.7的vlcdr2，氨基酸序列如seq id no.8的vlcdr3。

6、根据本发明另一个方面，还提供了一种生物材料，选自(ⅰ)～(ⅲ)中任一项：

7、(ⅰ)多核苷酸，包括编码上述的与hpv45型衣壳蛋白l1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列；

8、(ⅱ)载体，所述载体携带前述(ⅰ)多核苷酸；

9、(ⅲ)细胞，所述细胞携带(ⅰ)中多核苷酸，或含有(ⅱ)中载体，或表达上述的与hpv45型衣壳蛋白l1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

10、根据本发明另一个方面，还提供了一种分泌与hpv45型衣壳蛋白l1特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞，是保藏号为cgmcc no:45706的鼠源杂交瘤细胞株7a5，或是保藏号为cgmcc no：45707的鼠源杂交瘤细胞株11g1。

11、根据本发明另一个方面，还提供了一种上述与hpv45型衣壳蛋白l1特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或上述的生物材料，或上述的杂交瘤细胞在非诊断和治疗目的检测hpv45型衣壳蛋白l1，或在制备用于检测hpv45型衣壳蛋白l1的产品中的应用。

12、根据本发明另一个方面，还提供了一种上述的与hpv45型衣壳蛋白l1特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或上述的生物材料，或上述的杂交瘤细胞在疫苗生产或质控中的应用。

13、根据本发明另一个方面，还提供了一种用于检测hpv45型衣壳蛋白l1的试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包含上述的与hpv45型衣壳蛋白l1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

14、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

15、本发明通过杂交瘤技术筛选获得针对45型hpv的鼠源单克隆抗体及杂交瘤细胞，该抗体对hpv45 l1 vlps和假病毒具有高度的特异性和中和活性，表明该抗体是针对hpv45l1蛋白中和表位的抗体。通过直接elisa法检测该单抗的特异性，发现该抗体与hpv 6、hpv11、hpv 16、hpv 18、hpv 31、hpv 33、hpv 52、hpv 58等抗原均无交叉反应，特异性良好。通过elispot假病毒中和实验法检测该抗体的中和活性，显示对hpv45型假病毒具有高度的中和活性。同时对该抗体的重链可变区及轻链可变区基因进行测序，并对其cdr区进行分析，对该抗体进行了全面表征，得到了具有该cdr区域的与hpv45型衣壳蛋白l1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

16、基于该抗体或其抗原结合片段，本发明还建立了检测hpv45型衣壳蛋白l1抗原含量的方法，结果显示，该方法具有良好的特异性、灵敏度、线性和准确度，可以特异性快速鉴别并定量hpv45型衣壳蛋白l1抗原，对疫苗有效抗原成分的含量及活性进行评价，广泛应用于hpv疫苗的生产质控、临床病原学检测及流行病调查，对hpv疫苗的生产和宫颈癌的防控具有重要价值。