用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用。

背景技术：

1、尿路上皮癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，根据肿瘤部位主要包括膀胱癌(约占90％)、输尿管癌和肾盂癌(约占5％-10％)，其发病率及死亡率均占男性泌尿生殖系统肿瘤首位，且呈逐年上升的趋势。早期发现，早治疗对尿路上皮癌患者的预后有着十分重要的意义。

2、目前的临床诊断中，尿路上皮癌的检测主要通过膀胱镜、尿路脱落细胞及影像学(如彩色多普勒超声、电子计算机断层扫描(ct)、核磁共振成像(nmri)的检测方式。其中，膀胱镜被作为金标准检测手段，但其检测有创痛苦，患者依从性差且价格不菲，每位患者的检查过程长、效率低，难以推广和覆盖到相对大的群体(例如疾病普查时针对的群体)。而超声检查的灵敏度相对较低，患者需要储存尿液后实施检查，过程繁琐。因此，临床仍需要更好的技术来满足尿路上皮癌的早期诊断和密切的病情监测。

3、随着测序技术、芯片技术等的不断发展，技术人员致力于发现尿路上皮癌的分子标志物，例如位于染色体8p和9p的突变、成纤维细胞生长因子受体3(fgfr3)等被作为可选择的分子标志物。随着蛋白质技术的发展，技术人员也开发出了一系列尿肽，作为分子标记物。此外，mirna也被认为参与了尿路上皮癌的发生发展，人们试图分析血液中或尿液中mirna来甄别癌症。但是，由于特异性、准确性等限制因素的存在，上述一系列的方法仍然没有从根本上改变临床诊断现状，仍然高度依托于膀胱镜这类有创的诊断方式。

4、而技术的进一步发展中，dna甲基化分析也被技术人员所提出。尽管本领域中以及发明人的在先研究中，报道了一些甲基化水平异常的基因区及其检测，但是本领域仍然需要操作简单、具有较好的灵敏度及准确性、贴合临床规模化诊断需求且结果易于判读的检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用。

2、在本发明的第一方面，提供检测试剂在制备检测尿路上皮癌的试剂或试剂盒中的用途；其中，所述检测试剂为pcr引物和探针，靶向扩增seq id no:14所示核苷酸序列的核酸或其片段。

3、在一种或多种实施方式中，所述检测试剂所针对的待测样本为尿液样本。

4、在一种或多种实施方式中，所述尿路上皮癌包括：膀胱癌，输尿管癌，肾盂癌。

5、在一种或多种实施方式中，所述检测试剂还包括甲基化敏感性限制性内切酶，包括选自下组的酶或酶组合：hhai，bmgbi，haeii，rrui，taii。

6、在一种或多种实施方式中，所述酶组合为hhai和bmgbi。

7、在一种或多种实施方式中，所述hhai和bmgbi的酶组合中，按照体积hhai:bmgbi用量为1-3:1，较佳地1.5-2.5:1(如1.8-2.2:1)。

8、在一种或多种实施方式中，在使用时，所述甲基化敏感性限制性内切酶被添加于pcr反应体系中。

9、在一种或多种实施方式中，所述pcr引物扩增seq id no:14所示核苷酸序列中第33-165位的核酸片段；更佳地，所述引物为seq id no:1和seq id no:2所示核苷酸序列的引物。

10、在一种或多种实施方式中，所述探针靶向于seq id no:14所示核苷酸序列中第76-99位的核酸区段；较佳地，所述探针为seq id no:3所示核苷酸序列的探针。

11、在一种或多种实施方式中，所述检测试剂还包括：靶向扩增和检测内参基因的pcr引物和探针。

12、在一种或多种实施方式中，所述内参基因包括：内参g1和酶切内参g2。

13、在一种或多种实施方式中，扩增内参g1的引物为seq id no:8和seq id no:9所示核苷酸序列的引物；探针为seq id no:10所示核苷酸序列的探针。

14、在一种或多种实施方式中，扩增酶切内参g2的引物为seq id no:11和seq id no:12所示核苷酸序列的引物；探针为seq id no:13所示核苷酸序列的探针。

15、在一种或多种实施方式中，在用于pcr反应时，pcr体系中所述检测试剂具有下组的浓度：

16、seq id no:1所示核苷酸序列的引物：100±30nm(例如100±20nm，100±10nm，100±5nm)，较佳地100±10nm；

17、seq id no:2所示核苷酸序列的引物：100±30nm(例如100±20nm，100±10nm，100±5nm)，较佳地100±10nm；

18、seq id no:3所示核苷酸序列的探针：75±30nm(例如75±20nm，75±10nm，75±5nm)，较佳地75±10nm；

19、seq id no:8所示核苷酸序列的引物：150±30nm(例如150±20nm，150±10nm，150±5nm)，较佳地150±10nm；

20、seq id no:9所示核苷酸序列的引物：150±30nm(例如150±20nm，150±10nm，150±5nm)，较佳地150±10nm；

21、seq id no:10所示核苷酸序列的探针：125±30nm(例如125±20nm，125±10nm，125±5nm)，较佳地125±10nm；

22、seq id no:11所示核苷酸序列的引物：150±30nm(例如150±20nm，150±10nm，150±5nm)，较佳地150±10nm；

23、seq id no:12所示核苷酸序列的引物：150±30nm(例如150±20nm，150±10nm，150±5nm)，较佳地150±10nm；

24、seq id no:13所示核苷酸序列的探针：125±30nm(例如125±20nm，125±10nm，125±5nm)，较佳地125±10nm。

25、在本发明的另一方面，提供一种用于检测尿路上皮癌的检测试剂组，包括pcr引物和探针，靶向扩增seq id no:14所示核苷酸序列的核酸或其片段；较佳地，所述pcr引物扩增seq id no:14所示核苷酸序列中第33-165位所示的核酸片段；更佳地，所述引物为seqid no:1和seq id no:2所示的引物；较佳地，所述探针靶向于seq id no:14所示核苷酸序列中第76-99位所示的核酸区段；较佳地，所述检测试剂组中还包括：甲基化敏感性限制性内切酶，包括选自下组的酶或酶组合：hhai，bmgbi，haeii，rrui，taii；较佳地，所述酶组合为hhai和bmgbi；更佳地，所述hhai和bmgbi的酶组合中，按照体积hhai:bmgbi用量为1-3:1，较佳地1.5-2.5:1(如1.8-2.2:1)。

26、在一种或多种实施方式中，所述检测试剂组中还包括：所述检测试剂还包括：靶向扩增和检测内参基因的pcr引物和探针；较佳地，所述内参基因包括：内参g1和酶切内参g2；较佳地，扩增内参g1的引物为seq id no:8和seq id no:9所示核苷酸序列的引物；探针为seq id no:10所示核苷酸序列的探针；较佳地，扩增酶切内参g2的引物为seq id no:11和seq id no:12所示核苷酸序列的引物；探针为seq id no:13所示核苷酸序列的探针。

27、在本发明的另一方面，提供一种用于检测尿路上皮癌的检测试剂盒，其中含有前面所述的检测试剂组。

28、在一种或多种实施方式中，所述检测试剂组中每一种试剂被置于独立的容器中。

29、在一种或多种实施方式中，所述的检测试剂盒中还包括(但不限于)：dna提取试剂；pcr扩增体系试剂，包括(但不限于)选自：dna聚合酶，dntps。

30、在本发明的另一方面，提供一种检测待测样本的甲基化水平的方法，包括：(1)提取待测样品的核酸；(2)以(1)提取的核酸为模板，以pcr引物和探针扩增和检测其中seq idno:14所示核苷酸序列的核酸或其片段；同时在pcr反应体系中添加(有效量或足够量)甲基化敏感性限制性内切酶；较佳地，所述pcr引物扩增seq id no:14所示核苷酸序列中第33-165位的核酸片段；更佳地，所述引物为seq id no:1和seq id no:2所示核苷酸序列的引物；较佳地，所述探针靶向于seq id no:14所示核苷酸序列中第76-99位的核酸区段；较佳地，所述探针为seq id no:3所示核苷酸序列的探针；较佳地，所述检测试剂组中，还包括：甲基化敏感性限制性内切酶，包括选自下组的酶或酶组合：hhai，bmgbi，haeii，rrui，taii；较佳地，所述酶组合为hhai和bmgbi；更佳地，所述hhai和bmgbi的酶组合中，按照体积hhai:bmgbi用量为1-3:1，较佳地1.5-2.5:1(如1.8-2.2:1)；较佳地，在使用时，所述甲基化敏感性限制性内切酶被添加于pcr反应体系中；(3)分析(2)的pcr扩增产物；若发生对应seq idno:14所示核苷酸序列的核酸或其片段的特异性扩增(较佳地特异性扩增的ct较小；较佳地ct≤35)，则所述待测样本的甲基化水平异常(甲基化水平高于正常对照(健康对照))。

31、在一种或多种实施方式中，(3)中，通过分析pcr扩增产物的ct值，反应曲线或荧光值(所述探针为荧光探针)来评价所述甲基化水平。

32、在一种或多种实施方式中，所述方法中，还包括应用下组检测试剂：靶向扩增和检测内参基因的pcr引物和探针；较佳地，所述内参基因包括：内参g1和酶切内参g2；较佳地，扩增内参g1的引物为seq id no:8和seq id no:9所示核苷酸序列的引物；探针为seq idno:10所示核苷酸序列的探针；较佳地，扩增酶切内参g2的引物为seq id no:11和seq idno:12所示核苷酸序列的引物；探针为seq id no:13所示核苷酸序列的探针；其中，在同一pcr体系中检测所述seq id no:14所示核苷酸序列的核酸或其片段以及所述内参基因，分析扩增情况：若所述“内参g1”被早期扩增(相对早，例如ct值低于32，31，30，29，28，27，26，25，24，23，22，21或20)获得，所述“酶切内参g2”在晚于所述早期的节点被扩增(相对晚，例如ct值高于33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44或45)或无显著扩增，则表明待测样本的酶切效率高。

33、在一种或多种实施方式中，以基因甲基化检测分析软件(epiprobe biotech，eps-01)读值为判断标准，读值大于等于1为阳性，小于1为阴性(其中同时满足g1 ct小于33，且35/six6 ct大于等于1时，为阳性，35/six6小于1时为阴性；g1 ct大于等于33时，需复检)。

34、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。