一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法与流程

本发明涉及微生物检验，具体涉及一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法。

背景技术：

1、对药品非无菌产品中的微生物进行控制是对药物安全控制的基本检测项目。微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。按照微生物限度控制标准为≤500cfu/g，即细菌总数与霉菌酵母菌总数之和不得超过50cfu/g，每1g供试品应不得检出大肠埃希菌。

2、然而，对于某些特定药品(如罗红霉素)的微生物限度检查，由于药品具备抗菌活性，常规的微生物限度检查法无法实现，应首先消除其抗菌活性，并通过实验验证抗菌活性去除的是否彻底，以保证检验结果的有效性。

3、罗红霉素属于第2代大环内酯类抗生素，是有法国roessel vclaf公司开发，与红霉素抗菌机理相同。他们的关键反应是抑制50s核糖体中肽酰转移酶的活性，使得p位(供应)上的氨基酰trna结合，阻碍了肽键的形成，从而抑制细菌蛋白质合成作用。但由于大环内酯类抗生素都不易通过革兰氏阴性菌的细胞膜，导致罗红霉素对于常见的革兰氏阳性菌有强大的抗菌作用，对于部分革兰氏阴性菌有效。因此快速建立罗红霉素微生物限度检查法，成为研究重点。

4、现有技术中，即使采用目前微生物限度检查法中去除抑菌最有效的薄膜过滤法，也往往因为滤膜上残存的微量药物仍然能抑制阳性菌的生长，从而导致检测结果不准确。实验发现，在采用薄膜过滤法对罗红霉素进行微生物限度检查时，枯草芽孢杆菌回收比不符合规定，导致计数方法不适用，无法顺利完成罗红霉素原料药的微生物限度检查及计数方法的适用性试验和方法学验证。

5、解决这一问题目前能够采用的手段是降低样品浓度、加大冲洗量。药物在滤膜上的基本吸附量与冲洗达到一个平衡，使得增大冲洗量难以对其去除。长时间、大体积冲洗可能造成滤膜孔径的变化而使检验结果无效，也可能因为长时间液流的剪切力造成污染微生物体的死亡而出现漏检，降低检出率等。

6、鉴于此，进行深入研究后，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种罗红霉素原料药的微生物限度检查方法，本发明的检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确、稳定，避免了因罗红霉素造成的微生物生长抑制作用，使罗红霉素原料药的微生物限度检查得以顺利开展，克服了现有技术的不足。

2、本发明主要是通过如下技术方案实现的：

3、本发明提供一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法，采用薄膜过滤法对罗红霉素原料药进行微生物限度检查时，在缓冲液中加入5-10u的大环内酯酶；在培养基中加入5-10u的大环内酯酶、牛脑浸粉和牛心浸粉。

4、在本发明实施方案中，进行罗红霉素原料药微生物限度检查时，缓冲液和培养基中加入5u的大环内酯酶。

5、在本发明实施方案中，进行罗红霉素原料药微生物限度检查时，培养基和牛脑浸粉的质量比为(200-800):1，作为优选，培养基和牛脑浸粉的质量比为400:1。

6、在本发明实施方案中，进行罗红霉素原料药微生物限度检查时，培养基和牛心浸粉的质量比为(200-800):1，作为优选，培养基和牛心浸粉的质量比为400:1。

7、在本发明实施方案中，所述薄膜过滤法滤膜选择硝酸纤维素滤膜、聚氯乙烯滤膜、混合纤维微孔滤膜中的一种或多种，作为优选，薄膜过滤法中选择的是混合纤维微孔滤膜。

8、在本发明实施方案中，所述微生物限度检查包括需氧菌、霉菌、酵母菌和控制菌，其中，需氧菌包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌中的一种或多种的混合物，所述霉菌和酵母菌包括黑曲霉、白色念珠菌中的一种或两种的混合物，控制菌为大肠埃希菌。

9、在本发明实施方案中，一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法，其包括以下步骤：

10、(1)供试液配制：称取样品，并加入ph7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，摇匀静置，取上层液体作为1:10供试液待用；吸取1:10供试液，加入ph7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，摇匀静置，取上层液体作为1:100供试液；

11、(2)菌液制备：接种菌种至培养基，培养后，稀释成浓度为10～100cfu/ml的菌液；

12、(3)大环内酯酶储备液配制：取大环内酯酶，加入无菌水溶解，配制成浓度为10u/ml的储备液，待用；

13、(4)牛脑浸粉和牛心浸粉配制：取牛脑浸粉12.5g和牛心浸粉5.0g，分别加入250ml，配制成储备液，待用；

14、(5)培养基制备：取步骤(3)储备液加入到培养基中，迅速摇匀，制备成大环内酯酶5-10u的培养基；再加入牛脑浸粉和牛心浸粉，使得牛脑浸粉和牛心浸粉终浓度分别为12.5g/l及5.0g/l，待用；

15、(6)薄膜过滤：用含有大环内酯酶的冲洗液润洗滤膜后，取步骤(1)供试液，加入含有冲洗液的薄膜过滤器中，用冲洗液冲洗滤膜，在最后一次冲洗液中加入菌液，滤干后取出滤膜正放于步骤(5)培养基平板上，培养；

16、(7)平皿法：取步骤(1)中1:10供试液加入白色念珠菌菌悬液，混匀后取1ml加入平板，立即倾注步骤(5)的培养基，混匀，凝固，培养；

17、(8)微生物计数：点计滤膜及平皿上生长的所有菌落数；

18、(9)控制菌检查：取步骤(1)中1:10供试液加入滤杯中，加ph7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液过滤，冲洗后置于300ml培养基中，培养并观察。

19、在本发明实施方案中，

20、步骤(2)菌种为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌中的一种时，步骤(2)培养基为胰酪大豆胨液体培养基，培养条件为33℃培养24小时；

21、步骤(2)菌种为白色念珠菌及黑曲霉时，步骤(2)培养基为沙氏葡萄糖液体培养基，培养条件为23℃培养7天；

22、步骤(2)菌种为黑曲霉时，步骤(2)稀释剂为含0.05％聚山梨酯80的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

23、在本发明实施方案中，

24、当检查项目为需氧菌总数计数时，步骤(5)培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基；

25、当检查项目为霉菌和酵母菌总数计数时，步骤(5)培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基；

26、当检查项目为控制菌总数计数时，步骤(5)培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基。

27、在本发明实施方案中，步骤(6)中的冲洗液为无菌ph7.0氯化钠-蛋白胨溶液，冲洗液温度为37℃左右；步骤(6)中冲洗滤膜的冲洗量为100ml/次，共冲洗8次。

28、在本发明实施方案中，

29、当检查项目为需氧菌总数计数时，步骤(6)中培养条件为在30～35℃倒置培养3～5天；

30、当检查项目为霉菌和酵母菌总数计数时，步骤(6)中培养条件为在20～25℃倒置培养5～7天。

31、在本发明实施方案中，步骤(7)白色念珠菌菌悬液浓度为100～10000cfu/ml；培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基。

32、在本发明实施方案中，步骤(9)用300ml的ph7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次；所述培养基依次为胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯液体培养基以及麦康凯琼脂培养基。

33、本发明有益效果：

34、(1)本发明提供的罗红霉素原料药微生物限度检查方法采用薄膜过滤法，供试液1ml冲洗800ml，进行需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数的计数方法，通过滤膜的筛选，避免了滤膜自身对罗红霉素的吸附作用；通过在培养基和缓冲液中添加大环内酯酶，避免了罗红霉素造成的微生物生长抑制作用；通过向培养基中添加增菌液，使培养条件更适合微生物的生长，避免了假阴性结果的出现，各菌株回收比均符合规定。

35、(2)本发明的检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确、稳定，克服了现有技术的不足，使罗红霉素原料药的微生物限度检查得以顺利开展；

36、(3)该检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确、稳定，重现性好，可进行供试品需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数计数，适用于罗红霉素原料药的微生物限度检查以及计数方法的适用性试验和方法学验证；

37、(4)在不减少样品数量，且不增加冲洗量的基础上，仍能有效进行罗红霉素的微生物限度检查。