一种用于T4DNA连接酶的酶活检测试剂盒及酶活测定方法与流程

本发明涉及基因测序领域，更具体地说，本发明涉及一种用于t4 dna连接酶的酶活检测试剂盒及酶活测定方法。

背景技术：

1、在atp的供能辅助下，t4 dna连接酶催化粘性末端或平末端的双链dna上的3'羟基和5'磷酸末端形成磷酸二酯键。

2、目前，作为广泛使用的生物医学检测手段之一的基因测序技术，随着其技术的发展，实验所需酶用量逐步提高。现有基因测序技术中，存在多个步骤使用t4 dna连接酶的情况，所以t4 dna连接酶酶活的准确测定与否是影响基因测序反应顺利与否的至关重要的因素。

3、现阶段，对于半定量测定t4 dna连接酶酶活的方法中，通过凝胶电泳后成像进行灰度分析，存在受主观影响以及灰度分析不精准的缺点，使用此方法测定的t4 dna连接酶酶活误差较大，对于不同批次酶活相近的t4 dna连接酶的分辨率不高。现阶段可以较精准定量的t4 dna连接酶的活性测定方法大多使用荧光基团（如中国专利cn113061645a）或者染料（如中国专利cn104278090a）的荧光信号作为原始数据读取方式，尤其使用荧光基团的荧光信号变化作为结果输出的方式，成本较高，且由于实验仪器信号读取阈值的存在，荧光信号不能过低，导致荧光基团或者染料使用量较大（如中国专利cn108220386a），进一步提高了检测成本。并且底物多为噬菌体单链dna或者合成较长片段，噬菌体单链dna的获得成本较高。且对于有微生物发酵的需求的使用环境，使用噬菌体单链dna存在潜在的噬菌体残留风险，导致微生物发酵环境被破坏。现有方法中不使用噬菌体单链dna做反应底物的，则使用合成长片段，不仅由于片段较长造成的合成费用较高，同时合成的不同片段种类较多，进一步增加了合成费用，进而提高检测成本（如中国专利cn113061645a）。活性检测方法的试剂成本是使t4 dna连接酶活性测定门槛较高的因素之一，另一因素为测定仪器。现阶段的测定方法大多使用荧光作为测定依据，读取荧光基团或者染料的荧光信号基本上使用荧光酶标仪（如中国专利cn104278090a）或者荧光分光光度计（如中国专利cn 113061645a），对于一些使用者，需要特定准备荧光酶标仪或者荧光分光光度计，其中产生的硬件成本也进一步提高了t4 dna连接酶酶活测定门槛。另一方面，由于t4 dna连接酶为常温或低温即可催化反应的酶，在操作过程中可能已经开始发挥作用，所以操作步骤越多，越繁琐，产生操作误差的可能性越大，容错率较低，进一步提高了实施操作的门槛，降低了实际可行性和操作稳定性。

4、t4 dna连接酶的活性测定方法存在操作繁琐、步骤复杂的弊端，并且在实现成本上呈现底物片段合成成本高和实验仪器成本高，造成测活门槛较高。测活实验条件复杂、时间较长也是t4 dna连接酶测活不便的原因之一。

5、因此如何快速简洁且低成本的测定t4 dna连接酶酶活的问题亟需解决。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于t4 dna连接酶的酶活检测试剂盒及酶活测定方法，它可以快速准确地测定t4 dna连接酶的酶活，而且既不需要使用噬菌体单链dna作为反应底物，也不需要借助荧光基团或者染料，避免需要特定准备荧光酶标仪或者荧光分光光度计。

2、本发明用于解决技术问题的技术方案，具体如下：

3、在本发明的第一方面，提供了一种用于t4 dna连接酶的酶活检测试剂盒。

4、所述的试剂盒，包括用于检测t4 dna连接酶活性的反应底物原料；

5、所述的反应底物原料，包括独立的四条单链dna，所述四条单链dna分为两组；

6、第一组中第一条：5’ gacctctttatgatggaaatctagt 3’；核苷酸序列编号为seq idno：1；

7、第一组中第二条：5’ gtcaactagatttccatcataaagaggtc 3’，核苷酸序列编号为seq id no：2，其中第二条5’端修饰磷酸基团；

8、第二组中第一条：

9、5’agatacaagggtccagcaatttctcgtgcgggtgctcaactcaac 3’；核苷酸序列编号为seq id no：3；

10、第二组中第二条：

11、5’tgacgttgagttgagcacccgcacgagaaattgctggacccttgtatct 3’，核苷酸序列编号为seq id no：4，其中第二条5’端修饰磷酸基团。

12、进一步地，所述的试剂盒还包括t4 dna连接酶稀释液；

13、所述的t4 dna连接酶稀释液，包括以下组分：ph缓冲剂、螯合剂、去污剂、渗透压调节剂、防冻剂和还原剂。

14、优选地，所述t4 dna连接酶稀释液的ph为7.5-8.0。

15、优选地，所述ph缓冲剂选自tris-hcl、pbs、taps中的任意一种，优选tris-hcl。

16、优选地，所述螯合剂选自edta-2na、磷酸钠、dtpa中的任意一种，优选edta-2na。

17、优选地，所述去污剂选自tween-20、brij 58、triton x-100或其组合，优选tween-20。

18、优选地，所述渗透压调节剂选自kcl、cacl2、nacl、mgcl2或其组合，优选kcl。

19、优选地，所述防冻剂选自丙三醇、乙二醇或其组合，优选丙三醇。

20、优选地，所述还原剂选自dtt、β－巯基乙醇或其组合，优选dtt。

21、在本发明的优选实施方式中，

22、所述ph缓冲剂为tris-hcl，按t4 dna连接酶稀释液的总量计，tris-hcl的含量为10mm—60mm，较佳的，15mm—40mm，更佳的，20mm—30mm。

23、所述螯合剂为edta-2na，按t4 dna连接酶稀释液的总量计，edta-2na的含量为0.01mm—10mm，较佳的，0.1mm—1mm。

24、所述去污剂为tween-20，按t4 dna连接酶稀释液的总量计，tween20的含量为0.1%—2%（v/v），较佳的，0.5%—1.5%（v/v）。

25、所述渗透压调节剂为kcl，按t4 dna连接酶稀释液的总量计，kcl的含量为30mm—80mm，较佳的，40mm—60mm。

26、所述防冻剂为丙三醇，按t4 dna连接酶稀释液的总量计，丙三醇的含量为30%—70%（v/v），较佳的，40%—60%（v/v）。

27、所述还原剂为dtt，按t4 dna连接酶稀释液的总量计，dtt的含量为0.1mm—2mm，较佳的，0.5mm—1.3mm。

28、进一步地，所述的试剂盒还包括t4 dna连接酶反应缓冲液；

29、所述的连接酶反应缓冲液为10×t4 dna连接酶反应缓冲液，包括以下组分：ph缓冲剂、浓缩剂、酶激活剂、还原剂和atp。

30、优选地，所述10×t4 dna连接酶反应缓冲液的ph为7.5-8.0。

31、优选地，所述ph缓冲剂选自tris-hcl、pbs或taps，优选tris-hcl。

32、优选地，所述浓缩剂选自peg 6000、甘露醇或其组合，优选peg 6000。

33、优选地，所述酶激活剂选自mgcl2、mgso4或其组合，优选mgcl2。

34、优选地，所述还原剂选自dtt、β－巯基乙醇或其组合，优选dtt。

35、在本发明的优选实施方式中，

36、所述ph缓冲剂为tris-hcl，按10×t4 dna连接酶反应缓冲液的总量计，tris-hcl的含量为300mm—700mm，较佳的，400mm—500mm。

37、所述浓缩剂为peg 6000，按10×t4 dna连接酶反应缓冲液的总量计，peg 6000的含量为4%—10%（v/v），较佳的，6%—8%（v/v）。

38、所述酶激活剂为mgcl2， 按10×t4 dna连接酶反应缓冲液的总量计，mgcl2的含量为30mm—120mm，较佳的，80mm—100mm。

39、所述还原剂为dtt，按10×t4 dna连接酶反应缓冲液的总量计，dtt的含量为1mm—20mm，较佳的，5mm—13mm。

40、所述atp，按10×t4 dna连接酶反应缓冲液的总量计，atp的含量为8mm—20mm，较佳的，9mm—11mm。

41、在本发明的第二方面，提供了应用如第一方面所述试剂盒测定t4 dna连接酶酶活的方法。

42、所述的酶活测定方法过程如下：

43、将第一组的两条单链dna片段以100μm浓度按照摩尔比1:1混合，将第二组的两条单链dna片段以100μm浓度按照摩尔比1:1混合，分别在普通pcr仪中进行退火结合；退火结合过程为缓慢退火过程，由95℃缓慢降温到45℃，每10s降低1℃，以此来确保两对单链完全退火结合为两条双链，在普通pcr仪中设置退火程序条件如下表所示：

44、；

45、退火结合后分别形成两条含有粘性末端的双链dna，将退火结合后产物稀释50倍至1μm；

46、2）使用t4 dna连接酶稀释液将待测t4 dna连接酶稀释1000倍，测活反应体系配置如下，每20μl体系中，含有5μl第一组退火结合产物；5μl第二组退火结合产物；0.4μl稀释后的t4 dna连接酶；2μl10×t4 dna连接酶反应缓冲液，余量为水；

47、3）将配置好的测活反应体系振荡混匀、短暂离心后放入普通pcr仪中，pcr仪反应条件如下：

48、；

49、4）将反应后的产物进行毛细管电泳，计算主峰的面积，以面积与主峰所对应的片段大小计算得出主峰所对应的物质的量浓度，由主峰面积计算物质的量浓度由毛细管电泳仪软件计算；

50、第一组较短双链dna与第二组较长双链dna经t4 dna连接酶催化连接形成第三组产物双链dna，三个主峰由片段大小从短到长分别为第一组、第二组和第三组；由物质的量浓度计算连接效率从而测定t4 dna连接酶活性，其中计算连接效率公式如下：

51、连接效率=第三组物质的量浓度/（第三组物质的量浓度+第一组与第二组中浓度较小组物质的量浓度）×100%。

52、本发明的原理如下：

53、本发明首先制备t4 dna连接酶的酶促反应底物，以两对互补的单链退火结合形成两条含有粘性末端的双链，其中两者的粘性末端互补。两条双链的长度不同，以便在后续分析检测中进行区分。两条包含互补粘性末端的双链dna在t4 dna连接酶的酶促反应下相互连接为一条较长的双链dna，在反应结束后将反应体系中的t4 dna连接酶高温灭活。将反应体系进行毛细管电泳，同时使用毛细管电泳的结果分析软件对电泳出的三种不同长度的dna片段的摩尔浓度进行测定，以此来确定各片段的物质的量的比值。由于产生一分子的长片段产物需要两种底物各一分子，所以在计算连接效率时，连接效率=底物消耗量/底物起始量×100%=2×产物物质的量浓度/2×产物物质的量浓度+（第一组底物物质的量浓度+第二组底物物质的量浓度）×100%。由于在实际操作过程中，单链合成存在系统误差，第一组底物与第二组底物的物质的量浓度不会存在完全的浓度一致，所以在计算过程中以浓度较小的底物浓度为两组底物相同的初始浓度，即连接效率=2×产物物质的量浓度/2×（产物物质的量浓度+第一组与第二组底物中浓度较小组物质的量浓度）×100%=第三组物质的量浓度/（第三组物质的量浓度+第一组与第二组中浓度较小组物质的量浓度）×100%。

54、本发明具有如下技术效果：

55、1）本发明提供的t4 dna连接酶检测试剂盒及测活方法解决了现有测活方法操作繁琐、步骤复杂的弊端；不需要使用噬菌体单链dna作为反应底物，因此不会产生噬菌体残留的风险，也不需要借助荧光基团或者染料，避免了需要特定准备荧光酶标仪或者荧光分光光度计。

56、2）本发明提供的t4 dna连接酶检测试剂盒及测活方法，降低了t4 dna连接酶测活的仪器成本、耗材成本，从而降低测活门槛。

57、3）本发明提供的t4 dna连接酶检测试剂盒及测活方法，缩短了测活时间，减小测活过程中由于t4 dna连接酶低温反应造成的检测误差，提高测活准确性。