血液样本中白细胞去除缓冲液、包含其的试剂盒以及白细胞去除方法与病原体检测方法与流程

本发明涉及医学检测领域，特别地涉及血液样本中白细胞去除缓冲液、包含其的试剂盒以及白细胞去除方法与病原体检测方法。

背景技术：

1、血流感染(bloodstreaminfection，bsi)指患者血培养阳性并且有全身感染体征，血流感染可以是原发性的，也可以继发于其他部位感染(timsit j f,e ruppé,barbier f,et al.bloodstreaminfections in critically ill patients:an expert statement，2020.)。根据感染后症状不同，血流感染可分为菌血症(bacteremia)和败血症(septicemia)。菌血症是指病原体仅短暂入血，而无明显的临床症状，血液中的细菌可被免疫防御系统消灭，也被称为“自然菌血症”或“生理性菌血症”；败血症是宿主机体对感染的炎症反应，通常是全身血流感染的结果，被定义为由宿主对感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍(singer m,deutschman cs,seymour cw,shankar-hari m,annane d,bauer m,bellomo r,bernard gr,chiche jd,coopersmith cm,et al.the thirdinternational consensus definitions for sepsis and septic shock(sepsis-3).jama.2016feb 23；315(8):801–810.)，未经治疗的败血症可导致急性严重败血症或败血症休克，进一步引起器官衰竭而死亡。

2、血流感染在全世界范围内都有高致病率和死亡率，为了获得最佳的治疗效果，指南建议尽早开始广谱抗菌治疗，最好在发现败血症/败血症休克后一小时内开始(rhodeset al.,2017)，所以在疾病感染的早期，快速准确的病原体鉴定对抗生素治疗和抑制病情发展显得尤为重要。

3、目前，分离培养依然是临床上进行病原鉴定的金标准，但这种方法耗时长，经常需要至少24小时才能确定病原体；此外，血培养敏感也较差，其临床敏感性在很大程度上依赖于样本量，通常需要数十毫升的血液才能识别大多数病原体；而且对于一些难培养或无法培养的病原体，也难以进行准确鉴定和判断，这些导致临床无法快速有效用药，不能满足临床对血流感染这种严重紧急病症的诊疗。

4、随着分子诊断技术的发展，测序技术逐渐应用于临床，血浆游离dna(cell-freedna，cfdna)作为一种高特异性的标志物被越来越多应用于临床筛查及诊断。在血流感染领域，国内外有多家公司开展了基于血浆微生物游离dna(microbial cell-free，mcfdna)的病原体检测技术，以美国karius公司的karius test为例，其通过宏基因组二代测序(metagenomics next generation sequencing，mngs)对血浆mcfdna进行检测和病原体鉴定，该技术可发现细菌、真菌、寄生虫和dna病毒等传染性病原体释放到血液中的少量dna，并可在24小时内完成1000多种病原体的检测，应用非常广泛。目前，国内大多公司也是以mcfdna为标志物进行血流感染病原体鉴定，有临床研究表明，与血培养等临床综合判断相比，mngs临床敏感性和特异性可分别达到87.1％，80.2％(jing c,chen h,liang y,etal.clinical evaluation of an improved metagenomic next-generation sequencingtest for the diagnosis of bloodstream infections[j].clinical chemistry,2021(8):8.)，较传统检验方法耗时短，临床性能更好。

5、但由于血浆cfdna来源包括局灶感染、全身性血流感染、病原侵入人体细胞后释放的核酸片段等，为临床解读及感染定位造成一定困扰。血浆mcfdna是凋亡细胞释放出来的短核酸片段，可能会漏检厚壁菌(如真菌)、胞内菌(如结核)等；mcfdna平均长度只有40-100bp，对耐药基因检测不可靠；而且cfdna以凋亡病原为代表，半衰期较短，也会在一定程度上降低检测特异性。

6、全血样本中的病原为胞内活菌颗粒入血，具有完整的基因组，与血培养的靶标一致，检测全血中的病原体可以提高胞内菌及厚壁菌检出性能，对耐药基因检出也更加可靠，能为临床提供更多视角及解决线索，是理想的样本类型。但由于血液感染中病原微生物含量低，通常为10cfu/ml或更低，病原微生物靶标检测受到全血样本中大量红细胞、血红素、白细胞、人基因组等干扰。

7、使用血细胞检测血流感染，内源干扰和人源背景太高，检测灵敏度较差，具体表现为：①血细胞中含有大量红细胞，血红素对检测具有一定的干扰；②血细胞中含有大量的宿主白细胞，影响病原体在样本中的比例，对病原体检出有严重干扰，影响检测的灵敏度。目前该类研究并不多见，市面上未有灵敏度高、操作简单的相关试剂盒供使用。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种去除血细胞样本中白细胞的方法，包括：向样本中加入白细胞去除缓冲液；进行裂解反应15-40分钟；在裂解反应产物中加入dna酶缓冲液和dna酶；进行消化反应10-40分钟；获得去除白细胞的样本。

2、在一些实施例中，所述白细胞去除缓冲液包括：2m-6m的细胞裂解剂，其中包括胍盐；以及体积比为0.5％-2％的表面活性剂；其中白细胞去除缓冲液的ph为5-10，优选地，ph为7-9。

3、在一些实施例中，所述白细胞去除缓冲液中进一步包括第一ph缓冲液，所述第一ph缓冲液选自tris-酸体系、巴比妥钠-酸体系、磷酸二氢钾-碱体系、磷酸氢二钠-碱体系、硼砂-酸体系、硼砂-碱体系和甘氨酸-碱体系中的一个或者多个；优选地，所述第一ph缓冲液选自以下组分中的一个或者多个：tris-hcl、tris-ac、tris-so4缓冲液、tris-乙磺酸盐缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、硼砂-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和硼砂-氢氧化钠缓冲液。

4、在一些实施例中，所述胍盐选自以下组分中的一个或者多个：盐酸胍、异硫氰酸胍、硝酸胍、磷酸胍和碳酸胍；优选地，所述胍盐选自盐酸胍和/或异硫氰酸胍。

5、在一些实施例中，所述表面活性剂选自以下组分中的一个或者多个：tween-20，tritonx-100，sds，brijl23，chaps，优选tween-20和/或tritonx-100。

6、在一些实施例中，所述dna酶缓冲液包括1mm-10mm的镁离子。

7、在一些实施例中，所述镁离子来自以下组分中的一个或者多个：mgcl2、mgbr2、mgi2、mgso4、mg(no3)2、mg(oh)2。

8、在一些实施例中，所述dna酶缓冲液进一步包括5mm-30mm的第二ph缓冲液；其中所述第二ph缓冲液选自tris-酸体系、巴比妥钠-酸体系、磷酸二氢钾-碱体系、磷酸氢二钠-碱体系、硼砂-酸体系、硼砂-碱体系和甘氨酸-碱体系中的一个或者多个；优选地，所述所述第二ph缓冲液选自以下组分中的一个或者多个：tris-hcl、tris-ac、tris-so4缓冲液、tris-乙磺酸盐缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、硼砂-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和硼砂-氢氧化钠缓冲液。

9、在一些实施例中，所述dna酶选自以下组分中的一个或者多个：dnasei、turbodnase和benzonase核酸酶。

10、在一些实施例中，其中，所述白细胞缓冲液的体积为所述样本体积的3-8倍；优选地，所述白细胞裂解液的体积为所述样本体积的5倍；和/或所述dna酶缓冲液的体积为所述样本体积的0.5-3倍；优选地，所述dna酶缓冲液的体积为所述样本体积的0.7-2倍；更优选地，所述dna酶缓冲液的体积为所述样本体积的0.8-1.5倍；更优选地，所述dna酶缓冲液的体积为所述样本体积的1倍；和/或所述dna酶的体积为所述样本体积的0.01-0.05倍；优选地，所述dna酶的体积为所述样本体积的0.02倍。

11、在一些实施例中，其中，所述裂解反应的温度为15-28摄氏度；所述裂解反应的时间为16-35分钟；优选地，所述裂解反应的时间为17-30分钟；更优选地，所述裂解反应的时间为20分钟。

12、在一些实施例中，其中，所述消化反应的温度为37℃；所述消化反应的时间为15 -30分钟。

13、在一些实施例中，所述样本为血细胞样本；优选地，所述样本为去除红细胞后的血细胞样本。

14、一种样本中的白细胞去除缓冲液，包括：2m-6m的细胞裂解剂，其中包括胍盐；所述胍盐选自以下组分中的一个或者多个：盐酸胍、异硫氰酸胍、硝酸胍、磷酸胍和碳酸胍；优选地，所述胍盐选自盐酸胍和/或异硫氰酸胍；以及体积比为0.5％-2％的表面活性剂；所述表面活性剂选自以下组分中的一个或者多个：tween-20，tritonx-100，sds，brijl23，chaps，优选tween-20和/或tritonx-100；其中白细胞去除缓冲液的ph为5-10，优选地，ph为7-9。

15、在一些实施例中，所述白细胞去除缓冲液进一步包括第一ph缓冲液，其中所述第一ph缓冲液选自tris-酸体系、巴比妥钠-酸体系、磷酸二氢钾-碱体系、磷酸氢二钠-碱体系、硼砂-酸体系、硼砂-碱体系和甘氨酸-碱体系中的一个或者多个；优选地，所述第一ph缓冲液选自以下组分中的一个或者多个：tris-hcl、tris-ac、tris-so4缓冲液、tris-乙磺酸盐缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、硼砂-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和硼砂-氢氧化钠缓冲液。

16、一种样本中的白细胞去除试剂盒，包括：如上任一所述的样本中的白细胞去除缓冲液；dna酶缓冲液，其包括：1mm-10mm镁离子；以及dna酶。

17、在一些实施例中，其中所述镁离子来自以下组分中的一个或者多个：mgcl2、mgbr2、mgi2、mgso4、mg(no3)2、mg(oh)2。

18、在一些实施例中，其中所述dna酶缓冲液中进一步包括5mm-30mm第二ph缓冲液，所述第二ph缓冲液选自tris-酸体系、巴比妥钠-酸体系、磷酸二氢钾-碱体系、磷酸氢二钠-碱体系、硼砂-酸体系、硼砂-碱体系和甘氨酸-碱体系中的一个或者多个；优选地，所述所述第二ph缓冲液选自以下组分中的一个或者多个：tris-hcl、tris-ac、tris-so4缓冲液、tris-乙磺酸盐缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、硼砂-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和硼砂-氢氧化钠缓冲液。

19、在一些实施例中，所述dna酶选自以下组分中的一个或者多个：dnasei、turbodnase和benzonase核酸酶。

20、一种样本中病原体的检测试剂盒，包括如上任一所述的缓冲液；或者如上任一项所述的试剂盒。

21、一种样本中病原体的检测方法，包括：获得血细胞样本；去除样本中的红细胞；通过如上任一所述的方法去除样本中的白细胞；或者使用如上任一所述的缓冲液或者如上任一项所述的试剂盒去除样本中的白细胞；纯化病原体dna；获得病原体dna检测结果。

22、本发明主要通过去除全血或血细胞样本中的内源性及宿主干扰，建立血细胞样本病原体提取纯化的方法，进一步提高血流感染病原体检测的灵敏度，使检测结果具有更强的临床参考价值。