一种PRRSV非结构蛋白Nsp2合成肽多克隆抗体的制备及应用

本发明涉及生物，具体涉及一种prrsv非结构蛋白nsp2合成肽多克隆抗体的制备及应用。

背景技术：

1、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，prrsv)引发的一种烈性传染病。prrsv感染猪体引起免疫抑制，怀孕母猪出现流产、木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪呼吸系统为特征的疾病。目前按照抗原差异性将prrsv划分为两大基因型prrsv-1和prrsv-2，我国主要流行prrsv-2型毒株。

2、prrsv基因组具有高变异的特点，2006年我国暴发了高致病性prrsv，该毒株在非结构蛋白2(nonstructural proteins 2，nsp2)部分缺失30个氨基酸；我国新发的nadc34-like毒株在nsp2部分连续缺失100个氨基酸。prrsv nsp2基因高变异的原因是在nsp2高变区可以容忍碱基的突变、大片段序列缺失和外源基因或碱基序列的插入。鉴于prrsv nsp2基因变异的特点，常作为分子流行病学检测和研究的靶基因。

3、nsp2是一个多结构域且具有多种功能的蛋白，在prrsv的复制、宿主免疫应答的调控、抵抗宿主的抗病毒机制以及变异与演化等多方面具有重要的生物学功能，近年来nsp2的功能以及其发挥相关功能的分子机制已经成为研究的热点领域。

4、中国发明专利申请cn116444682a公开了一种靶向降解prrsv关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体及其应用。所述的生物型蛋白降解靶向嵌合体由1至多个prrsvnsp9纳米抗体nsp9nb及/或nsp2纳米抗体nsp2nb串联后再与e3泛素连接酶接头蛋白spop中btb结构域融合后得到。其利用筛选出的特异性结合prrsv关键复制酶nsp2，nsp9蛋白的纳米抗体，并用纳米抗体替代e3泛素连接酶复合体(spop)底物识别结构域，构建靶向降解prrsv关键复制酶的生物型蛋白降解靶向嵌合体，其并未涉及抗原肽及多克隆抗体。

5、中国发明专利申请cn116219068a通过对prrsv公开序列进行序列比对及分析，基于prrsv nsp2基因设计一组正反向引物，通过对经典株与高致病株序列进行比对，根据各类毒株的缺失特点，针对性地设计两种探针，通过特异性区分两种毒株，设计一种基于prrsv nsp2基因序列的rt-raa-lf检测方法，其并未涉及抗原肽及多克隆抗体。

6、基于此，特提出本发明。本发明通过对prrsv-nsp2进行抗原肽预测并制备了合成肽抗体，该抗体可以有效地用于不同毒株prrsv nsp2蛋白的检测，这为将来进行prrsvnsp2的研究以及prrsv的防控和诊断提供了有力的工具。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明公开一种猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2的抗原肽、利用该抗原肽制备的多克隆抗体及其应用。本发明所述的抗原肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。同时本发明还公开了上述抗原肽的制备方法以及利用该抗原肽制备的多克隆抗体。本发明制备的多克隆抗体的灵敏度和特异性较高，能够特异性识别nsp2蛋白，可用于nsp2蛋白的检测及其蛋白功能鉴定、细胞定位等，对于研究nsp2蛋白的生物学功能提供了重要的实验材料，并对猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测奠定了生物学基础。

2、本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

3、本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2蛋白多克隆抗体及其在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。

4、为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

5、本发明请求保护一种猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2的抗原肽，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2的抗原肽的氨基酸序列如seq id no.l所示。

6、本发明还请求保护一种由所述猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2的抗原肽免疫新西兰大白兔制备得到的多克隆抗体。

7、本发明还请求保护一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

8、a)制备合成肽抗原：人工合成seq id no.l所示的氨基酸序列，使用klh载体蛋白进行偶联纯化，得到合成肽抗原；

9、b)免疫新西兰大白兔：使用生理盐水对抗原肽稀释，按照1:1比例与弗氏佐剂混合乳化后免疫新西兰大白兔，获得包含多克隆抗体的血清；

10、c)多克隆抗体纯化：采用protein g亲和层析法对血清进行纯化，得到多克隆抗体。

11、优选地，所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2多克隆抗体的制备方法中，所述步骤b)中免疫方式为皮下注射或肌肉注射，抗原肽的每次免疫量500μg。

12、优选地，所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2多克隆抗体的制备方法中，所述步骤b)中免疫中每隔14天进行一次加强免疫，免疫六次后的第7天静脉或心脏采血获得包含多克隆抗体的血清。

13、优选地，所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2多克隆抗体的制备方法中，所述步骤b)中包括抗体效价检测，通过间接elisa法检测抗体的效价和灵敏度，所述的多克隆抗体的效价高达1:105。所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2多克隆抗体用含20％甘油的pbs缓冲液储存。

14、一种所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2多克隆抗体的应用，其用于nsp2的western blot和间接免疫荧光(ifa)检测，检测nsp2蛋白表达，优选地，所述的多克隆抗体用于细胞瞬时表达和不同毒株病毒感染的nsp2蛋白的表达检测，更优选地，所述的多克隆抗体用于nsp2的细胞定位。

15、本发明的有益效果在于：得到满足后续实验需求的nsp2多克隆抗体，能用于nsp2蛋白的表达及细胞定位检测，并用于不同毒株prrsv感染样品的检测，为研究prrsv nsp2的功能提供了一个有效的工具。

技术特征：

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2的抗原肽，其氨基酸序列如seq id no.l所示。

2.一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2的多克隆抗体，其特征在于，将权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2抗原肽经c端修饰后与klh载体蛋白交联后形成的复合蛋白作为免疫原，免疫动物制备而成。

3.一种权利要求2所述的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤:

4.根据权利要求3抗猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中免疫方式为皮下注射或肌肉注射，抗原肽的每次免疫量500μg。

5.根据权利要求3抗猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中每隔14天进行一次加强免疫，免疫六次后的第7天静脉或心脏采血获得包含多克隆抗体的血清。

6.根据权利要求3抗猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤d)中通过间接elisa法检测抗体的效价和灵敏度，所述的多克隆抗体的效价高达1：105，所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2多克隆抗体用含20％甘油的pbs缓冲液储存。

7.一种权利要求2所述的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2多克隆抗体的应用，其用于猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2蛋白表达检测。

8.根据权利要求7所述的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2多克隆抗体的应用，其特征在于，所述的多克隆抗体用于不同毒株的非结构蛋白2蛋白的表达检测。

9.根据权利要求7所述的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2多克隆抗体的应用，其特征在于，所述的多克隆抗体用于猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白的蛋白功能鉴定或细胞定位。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2的抗原肽、利用该抗原肽制备的多克隆抗体及其应用。本发明所述的抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。同时本发明还公开了上述抗原肽的制备方法以及利用该抗原肽制备的多克隆抗体。本发明制备的多克隆抗体的灵敏度和特异性较高，能够特异性识别Nsp2蛋白，可用于Nsp2蛋白的检测及其蛋白功能鉴定、细胞定位等，对于研究Nsp2蛋白的生物学功能提供了重要的实验材料，并对猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测奠定了生物学基础。

技术研发人员：邱亚峰,马志永,朱琳,魏建超,刘珂,李宗杰,李蓓蓓,邵东华
受保护的技术使用者：中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15