重组人透明质酸酶变体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种重组人透明质酸酶变体及其应用。

背景技术：

1、药物经皮下注射后，必须穿过皮下组织的细胞外基质，经毛细血管或淋巴管来进入循环系统，然而细胞外基质中透明质酸等糖胺聚糖通过自身的粘度与水和作用阻挡了分子扩散。以单克隆抗体为代表的蛋白药物进行皮下注射给药时，缓慢的药物吸收速度不利于半衰期较短的药物类型，且受限的给药体积使得目前大部分蛋白药物采用静脉注射的方法。透明质酸是由n-乙酰葡萄糖胺和d-葡萄糖醛酸组成的双糖单元通过β-1,4糖苷键重复连接组成的直链高分子多糖，在细胞外基质经过48小时内即可完成水解后的重建过程。透明质酸酶是一类可以将高分子透明质酸降解为双糖单元的水解酶，注射到皮下组织后可明显增加细胞外基质的通透性，促进药物吸收速度并增大给药体积。halozyme therapeutics开发的人透明质酸酶rhuph20(cho细胞表达)，通过与单克隆抗体等药物共处方并同时给药的方法已经应用于多个上市药物的皮下注射。

2、透明质酸酶还可从牛或绵羊的睾丸中提取，或从酵母、昆虫细胞表达重组人透明质酸酶，但动物组织提取的透明质酸酶易引发生物安全性的担忧。同时人透明质酸酶rhuph20含有6个n-linked糖基化位点，其糖基化类型对该酶的活性与稳定性具有决定性影响，异源表达方式也限制了rhuph20的应用。halozyme therapeutics首先通过在rhuph20羧基端逐步截短方法获得了可溶表达的蛋白序列；通过全局单点饱和酶变体的构建与筛选，获得了单位体积酶活性或稳定性大幅提升的酶变体，比如酶变体rhuph20-f204p的解链温度相比野生型提高了9℃。该研究充分展现了对透明质酸酶rhuph20进行分子改造具有提高酶活性与稳定性的潜力，这对降低生产成本与改善药物储存条件具有重要意义。但由于酶活性提高与稳定性提高的突变位点之间几乎没有重叠性，如何实现酶活性与稳定性的同步提升仍具挑战性。本领域仍需高活性与稳定性的重组人透明质酸酶变体。

技术实现思路

1、本发明针对重组人透明质酸酶进行分子改造研究，以期获得高活性与稳定性的重组人透明质酸酶变体，降低成本，造福病患。

2、本发明第一方面提供一种透明质酸酶变体，其具有ph20(例如rhuph20)或其截短变体的氨基酸序列或与其具有至少80％相同性的同源序列，并且在对应于seq id no:1的选自以下的一个或多个氨基酸位置具有突变：12、58、83、140、142、143、165、234、249、261、277、291、310、368、392、395、421、431、433、438、439、445。所述变体相比未突变的透明质酸酶具有更好的蛋白变性条件稳定性。所述蛋白质变性条件包含热或酚类防腐剂。所述热是高于或大约30℃的温度。

3、在一个或多个实施方案中，rhuph20的截短变体的氨基酸序列如seq id no:1所示。

4、在一个或多个实施方案中，所述变体的单位表达体积的总酶活性与酶稳定性均优于不含所述突变的相应透明质酸酶。

5、在一个或多个实施方案中，所述同源序列是源自灵长类动物的同源序列。

6、在一个或多个实施方案中，所述同源序列是源自人的同源序列。

7、在一个或多个实施方案中，所述同源序列与rhuph20或其截短变体具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、更优选至少99％相同性的序列。

8、在一个或多个实施方案中，同源序列的相应氨基酸位点通过与seq id no:1进行序列比对进行确定。

9、在一个或多个实施方案中，所述透明质酸酶变体在对应于seq id no:1的选自以下的一个或多个氨基酸位置具有突变：421、431、433、58、83、142、143、277、310、234、261、291、12和395。

10、在一个或多个实施方案中，所述透明质酸酶变体在对应于seq id no:1的选自以下任一组的氨基酸位置具有突变：

11、(1)58和83，(2)142和143，(3)277和310，(4)234和249，(5)261和291，(6)395和421，(7)431和433，

12、或者，

13、所述透明质酸酶变体在对应于seq id no:1的(a)所示的氨基酸位置具有突变：(a)421、431、433；任选还在选自(b)和/或(c)所示的氨基酸位置具有突变：(b)58、83，(c)142、143；进一步任选还在(d)所示的氨基酸位置具有突变：(d)277、310；更进一步任选还在选自234、261、12和395中的一个或多个位点具有突变。

14、在一个或多个实施方案中，在对应于seq id no:1的选自以下任一组的氨基酸位置具有突变：

15、(1)58和83，

16、(2)142和143，

17、(3)277和310，

18、(4)234和249，

19、(5)261和291，

20、(6)395和421，

21、(7)431和433，

22、(8)421、431、433和395，

23、(9)421、431、433、58、83和395，

24、(10)421、431、433、142、143和395，

25、(11)421、431、433、58、83、142、143和395，

26、(12)421、431、433、58、83、142、143、277、310和395，

27、(13)421、431、433、58、83、142、143、277和310，

28、(14)421、431、433、58、83、142、143、277、310和234，

29、(15)421、431、433、58、83、142、143、277、310、234和261，

30、(16)421、431、433、58、83、142、143、277、310、234、261和12。

31、在一个或多个上述实施方案中，各位置的突变为：位点12置换为e、位点58置换为k、位点83置换为v、位点140置换为k、位点142置换为p、位点143置换为k、位点165置换为f、位点234置换为m、位点249置换为v、位点261置换为n、位点277置换为k、位点291置换为v、位点310置换为q、位点368置换为r、位点392置换为q、位点395置换为a、位点421置换为h、位点431置换为k、位点433置换为v、位点438置换为n、位点439置换为a、位点445置换为m。

32、在一个或多个实施方案中，所述酚类防腐剂选自苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇和对羟基苯甲酸酯中的一种或多种。

33、在一个或多个实施方案中，所述变体通过选自糖基化、唾液酸化、白蛋白化、法尼基化、羧化、羟基化和磷酸化的修饰方式而修饰。

34、在一个或多个实施方案中，所述变体通过与聚合物缀合而修饰。优选地，所述聚合物是葡聚糖或peg。

35、在一个或多个实施方案中，所述变体通过与多聚化结构域、毒素、可检测标记或药物缀合而修饰。

36、在一个或多个实施方案中，所述变体是peg化的。

37、本发明还提供一种核酸分子，包含选自以下的序列：

38、(1)本文任一实施方案所述的透明质酸酶变体的编码序列，

39、(2)与(1)具有至少80％序列相同性的变体，

40、(3)(1)或(2)的互补序列。

41、本发明另一方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物：

42、(1)表达本文任一实施方案所述的透明质酸酶变体，和/或

43、(2)包含本文所述的核酸分子。

44、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体，例如克隆载体或表达载体。

45、本发明另一方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含、表达和/或分泌本文任一实施方案所述的透明质酸酶变体。

46、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞包含本文任一实施方案所述的核酸分子或核酸构建物。

47、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是cho细胞。

48、本发明还提供一种产生透明质酸酶变体的方法，包括：在适合产生、表达或分泌透明质酸酶变体的条件下培养本文所述的宿主细胞，和任选地，回收透明质酸酶变体。

49、在一个或多个实施方案中，从细胞、培养上清或含细胞的培养物中回收透明质酸酶变体。

50、本发明另一方面提供一种药物组合物，包括本文任一实施方案所述的透明质酸酶变体和药学上可接受的辅料。

51、在一个或多个实施方案中，所述药物组合物还包含酚类防腐剂。

52、在一个或多个实施方案中，所述酚类防腐剂选自苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇和对羟基苯甲酸酯中的一种或多种。

53、在一个或多个实施方案中，所述药物组合物还包含治疗剂。

54、在一个或多个实施方案中，所述治疗剂包括但不限于以下物质：化疗剂、止痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、杀阿米巴虫剂、杀毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟疾剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、抗关节炎剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、生物杀灭剂、杀菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药物、避孕药、减充血剂、利尿剂、抑郁剂、诊断剂、电解剂、催眠药、激素制剂、高血糖制剂、肌肉松弛剂、肌肉收缩剂、眼部用药、拟副交感神经剂、精神兴奋剂、镇静剂、拟交感神经剂、安定剂、杀病毒剂、维生素制剂、非类固醇抗炎剂、血管紧张素转换酶抑制剂、蛋白质、核酸、药物、有机分子和睡眠诱导剂。示例的治疗性蛋白质是抗体，特别是单克隆抗体、免疫球蛋白制备物、细胞因子、凝血因子和胰岛素。

55、本发明还提供本文任一实施方案所述的透明质酸酶变体在制备药物中的用途，所述药物：(1)用于促进治疗剂的扩散、输送、吸收或渗透，

56、(2)提高治疗剂的生物利用度，或

57、(3)用于治疗透明质酸相关疾病。

58、在一个或多个实施方案中，所述透明质酸相关疾病是水肿、血肿或积液。在一个或多个实施方案中，所述水肿是局部性水肿或全身性水肿。在一个或多个实施方案中，所述全身性是心源性水肿、肾源性水肿、肝源性水肿、营养不良性水肿、黏液性水肿、特发性水肿、药源性水肿、老年性水肿。在一个或多个实施方案中，所述局部性水肿是手术或创伤后局部水肿。

59、在一个或多个实施方案中，所述透明质酸相关疾病是受益于透明质酸低分子化作用的疾病，例如：乙酰透明质酸积聚或过度产生而引起的病症、炎症疾病、代谢疾病、心血管疾病、组织间隙液压升高、椎间盘压力升高、和肿瘤或癌症，包括晚期癌症、转移癌症和未分化癌症，如卵巢癌、原位癌(isc)、鳞状细胞癌(scc)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和结肠癌。所述透明质酸酶变体可以是修饰的，例如peg修饰。

60、本发明还提供促进治疗剂的扩散、输送、吸收或渗透的方法；提高治疗剂的生物利用度的方法；或治疗透明质酸相关疾病的方法，所述方法包括给予有效量的本文任一实施方案所述的透明质酸酶变体或药物组合物。

61、在一个或多个实施方案中，所述方法还包括给予有效量的所述治疗剂。

62、在一个或多个实施方案中，所述给予是胃肠外给予。

63、在一个或多个实施方案中，所述给予是静脉内或皮下给予。