水稻OsFLZ13在调控水稻育性和结实率的应用

本发明涉及基因工程，特别涉及一种水稻osflz13在调控水稻育性和结实率的应用。

背景技术：

1、水稻是世界上重要的粮食作物，在我国乃至世界农业生产中占有重要地位，也有非常可观的商业应用前景。因此其重要农艺性状基因功能的研究一直是社会广泛关注的热点，受到科研人员的重视。随着分子生物学和生物技术的发展，克隆水稻重要农艺性状的功能基因，利用基因编辑技术构建突变体材料，可以为水稻育种及品种改良提供基础，为水稻分子育种提供理论基础。

2、水稻的结实率是影响水稻产量的关键因素，而水稻良好的花粉活性是水稻良好结实率的重要基础。而水稻雄蕊的发育是一个复杂的过程，影响水稻花粉活力的因素复杂多样，包括花粉粒缺陷、胚囊异常和生殖期温度异常等。目前已报道了较多与水稻结实相关率的基因，如水稻光敏感核不育基因pms1的分离克隆及应用，pms1显性等位基因能降低长日照下nil(mh)结实率；水稻矮杆卷叶突变体(cdl)基因及其应用，其构建的水稻ac/ds插入突变体库中获得一个影响水稻整体生长发育的卷叶矮杆突变体，该突变体表现矮杆，叶片变短变窄并向内卷曲成半圆柱状，幼穗发育不良导致结实率大大降低。

技术实现思路

1、本发明提供了一种水稻osflz13在调控水稻育性和结实率的应用，依据osflz13基因序列，在基因反义链的上游和下游位置各设计1个20bp的编辑靶点，使用单子叶基因编辑载体试剂盒，构建双靶点crispr-cas9载体，并转化dh5α感受态细胞，平板培养，单菌落测序后采用农杆菌介导法转化中花11号愈伤，经培养获得转基因株系；利用潮霉素基因检测引物，pcr扩增筛选出阳性转基因株系，pcr扩增包含靶点的序列，测序获得基因编辑类型。

2、本发明提供了一种水稻osflz13在调控水稻育性和结实率的应用，osflz13基因的核苷酸序列包括如下核苷酸序列中的一种：

3、如seq id no.1所示的核苷酸序列；

4、如seq id no.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；

5、在严格条件下可以与如seq id no.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

6、进一步地，其中，osflz13蛋白包括如下蛋白中的一种：

7、(1)如seq id no.2所示的氨基酸序列；

8、(2)如seq id no.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

9、(3)与如seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。

10、进一步地，多个氨基酸的替换、插入或缺失时，氨基酸的个数小于等于10；

11、与如seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。

12、进一步地，与如seq id no.2所示的氨基酸序列具有95％同源性的氨基酸序列。

13、本发明还提供了一种降低水稻结实率的方法，突变水稻中osflz13基因，进而获得突变体植株。

14、进一步地，构建osflz13基因的crispr/cas9敲除载体并转化水稻植株。

15、进一步地，所述crispr/cas9敲除载体为phk1-cas-u3-osflz13。

16、进一步地，所述phk1-cas-u3-osflz13敲除载体的构建包括以下步骤：

17、s1、针对核苷酸序列如seq id no:1所示的osflz13基因选择靶位点并设计pcr引物，进行pcr扩增，获得含所述靶位点序列的线性dna片段；

18、s2、将上述线性dna片段连入phk1-cas-u3载体，构建得到phk1-cas-u3-osflz13敲除载体。

19、进一步地，步骤s1所述靶位点的序列为：5'-ccaaatccaccacttcctcg-3'、5'-agacacgccgttctgcagcg-3'。

20、进一步地，步骤s1中采用的引物分别为：

21、u3-osflz13-f:5'-cagtggtctcatgcaccaaatccaccacttcctcggttttagagctagaaatagc-3'；

22、u3-osflz13-r:5'-cagtggtctcaaaaccgctgcagaacggcgtgtcttgcaccagccgggaatcgaa-3'。

23、本发明的有益效果为：

24、本发明通过基因敲除实验在水稻中验证了基因osflz13的在降低水稻结实率上的功能；通过构建crispr/cas9基因敲除载体转化水稻，获得突变体植株，观察两个突变株系的t1代植株的小花，发现和野生型植株在花药发育的第13阶段有明显差异，突变体花药变小而雌蕊无明显差异。对突变体开花前的花粉碘染，显示osflz13-1和osflz13-2均有一半以上的花粉败育。野生型的穗粒饱满稻穗弯曲，突变体植株有大量空瘪种子稻穗直立。野生型结实率高达94％，突变体结实率显著降低。突变体osflz13-1和osflz13-1的结实率分别只有44％和36％。表明osflz13基因具有调控水稻结实率的功能，本发明揭示了osflz13基因于降低水稻结实率上的生物学功能，为阐明结实率这一复杂的农艺性状相关的分子机制提供了新的思路，为进一步水稻产量育种研究和利用奠定理论基础，为水稻育种提供了潜在的新基因资源。

技术特征：

1.一种水稻osflz13在调控水稻育性和结实率的应用，其特征在于，osflz13基因的核苷酸序列包括如下核苷酸序列中的一种：

2.根据权利要求1所述的水稻osflz13在调控水稻育性和结实率的应用，其特征在于，其中，osflz13蛋白包括如下蛋白中的一种：

3.根据权利要求2所述的水稻osflz13在调控水稻育性和结实率的应用，其特征在于，

4.根据权利要求3所述的水稻osflz13在调控水稻育性和结实率的应用，其特征在于，与如seq id no.2所示的氨基酸序列具有95％同源性的氨基酸序列。

5.一种降低水稻结实率的方法，其特征在于，突变水稻中osflz13基因，进而获得突变体植株。

6.根据权利要求5所述的降低水稻结实率的方法，其特征在于，构建osflz13基因的crispr/cas9敲除载体并转化水稻植株。

7.根据权利要求6所述的降低水稻结实率的方法，其特征在于，所述crispr/cas9敲除载体为phk1-cas-u3-osflz13。

8.根据权利要求7所述的降低水稻结实率的方法，其特征在于，所述phk1-cas-u3-osflz13敲除载体的构建包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的降低水稻结实率的方法，其特征在于，步骤s1所述靶位点的序列为：5'-ccaaatccaccacttcctcg-3'、5'-agacacgccgttctgcagcg-3'。

10.根据权利要求9所述的降低水稻结实率的方法，其特征在于，步骤s1中采用的引物分别为：

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，公开了水稻OsFLZ13在调控水稻育性和结实率的应用，OsFLZ13基因的核苷酸序列包括如下核苷酸序列中的一种：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；在严格条件下可以与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。本发明依据OsFLZ13基因序列，在基因反义链的上游和下游位置设计编辑靶点，构建双靶点CRISPR‑Cas9载体，并转化DH5α感受态细胞，平板培养，单菌落测序后采用农杆菌介导法转化中花11号愈伤，经培养获得转基因株系。

技术研发人员：胡利华,张丽洁,王令强,杨明冲,李波
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15