一种通用型总RNA提取方法及提取试剂盒与流程

本发明属于rna提取，更具体地，涉及一种通用型总rna提取方法及提取试剂盒。

背景技术：

1、目前生物学研究已经从基因组时代跨入了后基因组时代，如转录组学即对生物的另一重要遗传基础——整体rna的转录水平及转录调控规律进行探索，并在生物学前沿研究中得到了广泛的应用。转录组学作为一项前沿技术，在疾病研究、药物开发和个性化医疗等领域发挥着关键作用。通过深入理解基因表达的差异和调控机制，我们可以揭示生物体的复杂性，并为未来的生物医学研究和应用提供新的方向和机会。而rna的提取是转录组学的基础，因此能否提取纯度高且结构完整的rna是影响转录组学研究的一个重要因素。

2、现有rna提取方法主要包括trizol提取法、ctab法等溶液法，以及离心柱法和磁珠法等rna抽提纯化试剂盒提取法。其中trizol提取法和ctab法通常使用有毒试剂如苯酚氯仿、巯基乙醇等，提取时间较长且rna产物提取浓度低、受基因组dna残留影响严重导致rna纯度较低等问题。离心柱法虽不使用苯酚、氯仿等有毒物质，但需要多步离心，易造成rna降解，提取的rna纯度不稳定等；而现有自动化核酸提取仪以及磁珠法rna提取试剂盒，虽解决了多次离心，操作麻烦的问题，但目前这类提取试剂盒适配核酸提取仪器程序需要自行摸索，且适配样本类型单一，而且现有提取方法提取过程gdna去除不彻底，导致采用核酸提取仪提取的rna混有gdna且市售试剂盒提取不同样本稳定性较差。

3、专利cn 116286800 a一种高通量总rna提取试剂盒及提取方法，该专利虽然提供了匹配市场上各类磁棒法全自动化核酸提取设备的rna提取方法，但上机前样品裂解后需要经过氯仿抽提、多次离心后先机外dnasei消化再漂洗液洗涤，不利于高通量快速提取。因此研究一种兼容多种样本类型且提取的rna无基因组dna污染，能够高通量快速提取的提取方法和试剂盒，利于应用于二代测序产业、分子检测等需样本量大、检测周期短的领域。

技术实现思路

1、针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种通用型总rna提取方法及提取试剂盒，其目的在于发现在洗涤液i洗涤后，先采用洗涤液ii洗涤一次，再加dnase i消化，消化反应后直接添加洗涤液ii进行再结合和第二次洗涤，能够在消化过程中彻底除去基因组dna，避免提取的rna受基因组dna的影响，提取的rna纯度更高，且能够用于提取细胞、血液、组织或细菌中总rna，由此解决现有常规提取方法难以彻底除去基因组dna且适用性较单一的技术问题。

2、为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种通用型总rna提取方法，其用于提取细胞、血液、组织或细菌中总rna，具体包括以下步骤：

3、(1)裂解结合：收集待提取样品，加入裂解液，振荡混匀2-5min；加入与裂解液等体积的结合液、磁珠悬浮液，混匀静置；

4、(2)除去基因组dna：按照洗涤液i洗涤一次或两次，弃液加洗涤液ii洗涤一次，弃液加dnase i消化彻底除去基因组dna，dnase i消化反应结束后直接加洗涤液ii进行再结合和第二次洗涤；洗脱液洗脱获得rna。

5、优选地，所述通用型总rna提取方法，其所述dnase i消化，按照5-20u/样品加入dnase i。

6、优选地，所述通用型总rna提取方法，其所述洗涤液i，包括1-4m异硫氰酸胍、1-20mm edta、0.5％-5％洗涤剂和30％-80％乙醇，其中洗涤剂，包括triton-x-100、np-40或吐温-20；所述洗涤液ii，为65％-90％乙醇。

7、优选地，所述通用型总rna提取方法，其所述裂解液包括1-6m异硫氰酸胍、0.1％-0.5％(w/v)十二烷基磺酸钠、0.1％-1％(w/v)十二烷基肌氨酸钠、0-100mm柠檬酸钠、10-200mm硫脲和1-3％曲拉通-x-100。

8、优选地，所述通用型总rna提取方法，其所述结合液为60％-100％异丙醇或者无水乙醇。

9、优选地，所述通用型总rna提取方法，其所述提取细胞rna，结合液为60％-100％异丙醇。

10、优选地，所述通用型总rna提取方法，其所述dnase i消化，按照10-15u/样品加入dnase i。

11、优选地，所述通用型总rna提取方法，其所述洗涤液i为3m异硫氰酸胍、5mm edta、1％ triton-x-100和50％乙醇；所述洗涤液ii为75-80％乙醇。

12、按照本发明的另一方面，还提供了一种通用型rna提取试剂盒，其所述试剂盒，包括裂解液、结合液、磁珠悬浮液和dnaseⅰ；

13、所述裂解液包括1-6m异硫氰酸胍、0.1％-0.5％(w/v)十二烷基磺酸钠、0.1％-1％(w/v)十二烷基肌氨酸钠，0-100mm柠檬酸钠，10-200mm硫脲和1-3％曲拉通-x-100；

14、所述结合液为60％-100％异丙醇或者无水乙醇；

15、所述磁珠悬浮液为硅基磁珠，粒径范围为20-400nm，含量为10-200mg/ml。

16、优选地，所述通用型rna提取试剂盒，其所述试剂盒，还包括洗涤液i和洗涤液ii；

17、所述洗涤液i，包括1-4m异硫氰酸胍、1-20mm edta、0.5％-5％洗涤剂和30％-80％乙醇，其中洗涤剂，包括triton-x-100、np-40或吐温-20；

18、所述洗涤液ii，为65％-90％乙醇。

19、总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于本发明对现有rna提取方法进行改进，能够取得下列有益效果：

20、本发明提供的通用型总rna提取方法，在洗涤液i洗涤后先采用洗涤液ii洗涤一次，在洗涤过程中能够除去残留的gitc，sls，triton x-100等表面活性剂，可避免dnasei活性被破坏或受到抑制，使得dnasei活性高效发挥，能够彻底除去gdna；在dnasei消化反应后因体系中没有gitc，sls，triton x-100等试剂残留且盐离子浓度较低，rna会从磁珠上游离到体系中，再添加洗涤液ii在洗涤过程中能够在除去dnasei和盐离子的同时使rna重新结合于磁珠上，更佳利于除去其他杂质而保留更多的rna，实验结果表明，本发明提取的rna产量明显高于现有提取方法且提取rna的纯度更高，可以直接进行下游分析，同时适配多款核酸提取仪。

技术特征：

1.一种通用型总rna提取方法，其特征在于，用于提取细胞、血液、组织或细菌中总rna，具体包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的通用型总rna提取方法，其特征在于，所述dnase i消化，按照5-20u/样品加入dnase i。

3.如权利要求1或2所述的通用型总rna提取方法，其特征在于，所述洗涤液i，包括1-4m异硫氰酸胍、1-20mm edta、0.5％-5％洗涤剂和30％-80％乙醇，其中洗涤剂包括triton-x-100、np-40或吐温-20；所述洗涤液ii，为65％-90％乙醇。

4.如权利要求3所述的通用型总rna提取方法，其特征在于，所述裂解液包括1-6m异硫氰酸胍、0.1％-0.5％十二烷基磺酸钠、0.1％-1％十二烷基肌氨酸钠、0-100mm柠檬酸钠、10-200mm硫脲和1-3％曲拉通-x-100。

5.如权利要求4所述的通用型总rna提取方法，其特征在于，所述结合液为60％-100％异丙醇或者无水乙醇。

6.如权利要求1至5任意一项所述的通用型总rna提取方法，其特征在于，所述dnase i消化，按照10-15u/样品加入dnase i。

7.如权利要求6所述的通用型总rna提取方法，其特征在于，所述洗涤液i为3m异硫氰酸胍、5mm edta、1％triton-x-100和50％乙醇；所述洗涤液ii为75-80％乙醇。

8.一种通用型rna提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒，包括裂解液、结合液、磁珠悬浮液和dnaseⅰ；

9.如权利要求8所述的通用型rna提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒，还包括洗涤液i和洗涤液ii；

技术总结
本发明公开了一种通用型总RNA提取方法及提取试剂盒，其用于提取细胞、血液、组织或细菌中总RNA，包括裂解结合：收集待提取样品，加入裂解液，振荡混匀2‑5min；加入与裂解液等体积的结合液、磁珠悬浮液，振荡混匀；除去基因组DNA：洗涤液I洗涤1～2次，弃液加洗涤液II洗涤一次，弃液加DNase I消化彻底除去基因组DNA，消化后直接加洗涤液II进行再结合和第二次洗涤；洗脱液洗脱获得RNA。洗涤液I洗涤后先用洗涤液II洗涤一次，再加DNase I消化，能够在消化过程中彻底除去基因组DNA，避免受基因组DNA的影响，提取的RNA纯度更高；同时能应用于多款磁棒法核酸提取仪，可自动化高通量提取RNA。

技术研发人员：晋莲,李慧,高钟,潘超
受保护的技术使用者：武汉纳磁生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16