一种产5-氨基乙酰丙酸的基因重组贝莱斯芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和微生物代谢工程，特别涉及一种产5-氨基乙酰丙酸的基因重组贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

1、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ala)是生物体合成叶绿素、血红素和维生素b12等四吡咯类化合物的必需前体，对植物光合作用和细胞能量代谢具有重要作用。5-氨基乙酰丙酸可广泛用于农业和医药领域。在农业领域，5-氨基乙酰丙酸作为新型的植物生长调节剂、绿色除草剂和无毒杀虫剂等发挥着重要作用。在临床医学中，5-氨基乙酰丙酸作为一种疗效极高、副作用极小的光动力学药物，应用于多种癌症的诊断和治疗。

2、目前，5-氨基乙酰丙酸的生产大都是化学合成，也有部分是生物合成，5-氨基乙酰丙酸的生物合成方法有2种法，一是生物诱变法。sasaki等(biosynthesis，biotechnological production and applications of5-aminolevulinic acid.applmicrobiol biotechnol，2002，58：23-29)优化类球红细菌的突变株(rhodobactersphaeroides)的培养条件，将ala的产量提高到1.3g/l。但生物诱变法培养条件复杂、周期长、成本较高。而另一种方法就是基因工程方法，mariet等人分别构建了含有类球红细菌(rhodobacter sphaeroides)和大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobium japonicum)的ala合成酶基因(hema)的工程菌，获得了高产量的ala，其产量分别达到3.21g/l和2.94g/l。由于重组工程菌产量高、发酵时间短，成本相对较低，其将是今后ala大规模生产的一项很有前景的生物技术。但鲜有报道关于芽孢杆菌作为产5-氨基乙酰丙酸的工程菌，研发出一种产5-氨基乙酰丙酸的贝莱斯芽孢杆菌对微生物代谢工程技术领域具有重要意义。

技术实现思路

1、针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种产5-氨基乙酰丙酸的基因重组贝莱斯芽孢杆菌及其应用，通过将大豆慢生根瘤菌的hema基因整合至贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)的基因组中，得到了一种能够合成5-氨基乙酰丙酸的工程菌，具体通过以下技术实现：

2、本发明的第一方面，提供了一种产5-氨基乙酰丙酸的基因重组贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，是通过将大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobium japonicum)的hema基因整合至贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)的基因组中得到的基因重组工程菌。

3、进一步地，整合1-3个上述hema基因到贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)的基因组中。

4、进一步地，上述hema基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、进一步地，上述基因重组贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)以贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)r9的基因组中2，3-丁二醇还原酶基因bdh、γ-pga合成基因pgsb以及生物被膜调控基因sini的至少1个为所述hema基因的整合位点。所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)r9已于2023年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为cctcc no：m 20231199。

6、更进一步地，是以贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)r9的基因组中2，3-丁二醇还原酶基因bdh、γ-pga合成基因pgsb以及生物被膜调控基因sini同时为所述hema基因的整合位点，得到基因重组贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)r9-3；所述基因重组贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)r9-3已于2023年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为cctcc no：m 20231200。

7、其中，所述2，3-丁二醇还原酶基因bdh的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述γ-pga合成基因pgsb的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述生物被膜调控基因sini的核苷酸序列如seq id no.4所示。

8、一般地，将大豆慢生根瘤菌c4途径中合成5-氨基乙酰丙酸的关键基因hema整合至贝莱斯芽孢杆菌中都能获得产5-氨基乙酰丙酸的工程菌，拷贝三个hema基因能使该基因充分表达，有利于发酵产生的5-氨基乙酰丙酸的浓度提升。本发明整合位点选择从贝莱斯芽孢杆菌r9基因组中组成型启动子活性以及调控生物被膜相关的基因出发，进行整合表达。

9、本发明的第二方面，提供上述基因重组贝莱斯芽孢杆菌的构建方法，包括步骤：

10、(1)通过pcr克隆大豆慢生根瘤菌的hema基因和贝莱斯芽孢杆菌基因组中整合位点的上下游约50bp的同源臂编码区，并通过重叠延伸pcr(soe-pcr)融合，构建重组表达质粒；

11、(2)将上述重组表达质粒转化至贝莱斯芽孢杆菌中，通过抗性筛选得到阳性克隆，再经过菌落pcr得到转化成功的菌株；

12、(3)经过双交换的第一次交换以及引物验证得到单交换菌株，再通过双交换的第二次交换、抗性筛选和测序验证，得到产5-氨基乙酰丙酸的贝莱斯芽孢杆菌。

13、双交换的本质其实是在单交换的基础上，第二次发生单交换。在温度较低的培养环境下，整合在基因组上的质粒中的同源臂，容易与基因组上的同源臂再次配对发生交换，再次交换的结果可能是在另一条同源臂上发生交换，则会将目的基因整合到靶基因位点，也可能是在第一次交换的同源臂上再次发生交换则会恢复到野生型菌株，所以需要进行测序验证目的片段的大小来判断是否得到贝莱斯芽孢杆菌r9-3。

14、本发明的第三方面，提供一种发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法，具体将上述基因重组贝莱斯芽孢杆菌以1％的接种量接种至发酵培养基中，于37℃、180-200r/min培养34-38h。

15、进一步地，上述发酵培养基的配方为：(nh4)2so4 16-17g/l、kh2po4 3g/l、na2hpo4·12h2o 16-17g/l、mgso4·7h2o 1g/l、酵母提取物2g/l、甘氨酸3g/l、葡萄糖20g/l。

16、本发明的第四方面，提供了上述基因重组贝莱斯芽孢杆菌在提升烟草抗逆能力中的应用，具体将所述贝莱斯芽孢杆菌的发酵液喷洒至烟草叶片上。

17、本发明的第五方面，提供了一种提升烟草抗逆能力的产品，主要功能组分为上述基因重组贝莱斯芽孢杆菌的发酵液。

18、上述基因重组贝莱斯芽孢杆菌的发酵液能够显著提升逆境胁迫下烟草的生长能力，主要表现为有效提升烟草的pod酶活性、sod酶活性、cat酶活性、叶绿素含量，这主要是由于发酵液中含有5-乙酰氨基丙酸(5-ala)，能够有效诱导植株的抗逆性。

19、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

20、1、本发明提供的一种产5-氨基乙酰丙酸的基因重组贝莱斯芽孢杆菌，在5-氨基乙酰丙酸检测培养基中能够发酵产生17mg/l的5-氨基乙酰丙酸，相较于贝莱斯芽孢杆菌r9而言浓度提升了3倍多，说明该贝莱斯芽孢杆菌是产5-氨基乙酰丙酸的理想工程菌。

21、2、该贝莱斯芽孢杆菌还能有效拮抗青枯雷尔氏菌，同时，其发酵液能够显著提升逆境胁迫下烟草的生长能力。