醇酰基转移酶、工程菌株及其应用

本发明属于生物。

背景技术：

1、丁酸丁酯(butyl butyrate，简称bb)又称酪酸丁酯，是一种短链酯，具有菠萝香味。人们发现自然界中的酸甜风味通常是由于丁酸丁酯和其他短链酯的存在，丁酸丁酯存在于花朵、水果和发酵饮料中。根据《gb 1886.286—2016食品安全国家标准食品添加剂丁酸丁酯》，具有独特香味的丁酸丁酯可作为食品的香味添加剂，常用于糖果、饼干、汽水、面包、冰淇淋等食品中，也作为香料被广泛用在香水和化妆品中的；丁酸丁酸还具有优良的溶剂特性，被用做有机合成的原料和中间体，常用于合成硝化纤维素、虫胶、香豆酮树脂和涂料；丁酸丁酯本身具有高燃烧值，研究认为是最有前途的喷气机燃料混合物。

2、工业上合成丁酸丁酯常用化学催化法生产，通常是由正丁酸和正丁醇在催化剂作用下酯化而成，传统的生产工艺是以浓硫酸为催化剂，但存在副反应多、后处理工艺复杂、设备腐蚀严重以及废酸污染环境等弊端，人们开发了代替浓硫酸的新型催化剂如对甲苯磺酸、氨基磺酸、十二水合硫酸铁铵和固体超强酸等，使用这些化学催化剂具有催化时间短和酯化效率高的特点，但是还是存在污染环境，催化剂的回收利用步骤繁琐，后处理工艺复杂等问题。

3、近年来，生物合成丁酸丁酯成为趋势。主要有两种方法，一是酶法催化，酶法催化合成丁酸丁酯中比较成功的是用脂肪酶进行的，脂肪酶又名甘油酯水解酶，可催化三酰甘油水解生成游离脂肪酸和甘油，除了水解活性，还可催化酯化反应、转酯反应、氨解反应等，脂肪酶参与的催化酯化反应具有不需要辅酶、反应条件温和、副产物少等优点。但脂肪酶催化的酯化反应也有一些缺点：(1)使用脂肪酶的成本比较高，每克的价格高达百元。(2)催化时需额外加入丁醇或丁酸，如2016年，fengxue xin等使用可产丁醇的菌株clostridiumsp.strain boh3，以candida rugosa来源的脂肪酶为催化剂，在含有70g/l的木糖中发酵产生丁醇，分别在48h和72h补加丁酸，以煤油为萃取剂，发酵122h时在有机相中检测到22.4g/l的丁酸丁酯；2017年，zhong-tian zhang等人，使用一株丁酸梭菌c.tyrobutyricum atcc25755，以葡萄糖为底物产丁酸，发酵中持续加入丁醇维持其终浓度为10g/l，使用candidasp.来源的脂肪酶为催化剂，在将近125h时得到了34.7g/l的丁酸丁酯；(3)脂肪酶催化的反应为可逆反应，必须在反应体系中加入大量的萃取剂如十六烷、煤油等，及时移走产物，以利于酯化反应的进行。

4、二是发酵法，在发酵法研究中，使用醇酰基转移酶(alcohol acyl-transferase，简称aat)将丁酰辅酶a的丁酰基转移至丁醇上获得丁酸丁酯，目前用于合成丁酸丁酯的醇酰基转移酶一般为来自草莓(fragaria ananassa)的saat或野草莓(fragaria vesca)的vaat，得到的菌株丁酸丁酯产量非常低。公开报道的有如下几项研究：2016年，donovans.layton等人构建酸到醇的合成途径，有机酸在酰基coa转移酶(act，acyl coatransferase)作用下转化成相应的酰基coa，再由adhb生成醇，表达的saat可催化途径中的酰基coa和醇生成酯，最终工程菌株可以在补加丁酸的情况下，利用葡萄糖发酵合成47.63mg/l的丁酸丁酯；2022年，jong-won lee等使用蛋白融合标签和伴侣蛋白提高所构建途径中酶的可溶性表达，并表达saat，使丁酸丁酯的产量达到449.6mg/l。王菊芳等在酪丁酸梭菌中表达c.acetobutylicum atcc824来源的adhe2和fragaria vesca来源的vaat，以葡萄糖为底物，在补加丁醇的条件下，可以合成3.78g/l的丁醇。总的来看，目前发酵法生产丁酸丁酯有两个问题，一是需要额外添加加丁酸或丁醇，这说明醇酰基转移酶的底物的来源受限，二是，关键酶醇酰基转移酶的活性不足，因此，本专利中使用丁醇生产菌eb243(董红军，等人.高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用.中国，cn201610204922.2017-10-24)为宿主，并挖掘新的高活性醇酰基转移酶。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供了一种高活性醇酰基转移酶，所述醇酰基转移酶氨基酸序列具有如seq id no1所示的氨基酸序列。

2、在本发明的具体实施例中，所述醇酰基转移酶来源于甜橙(citrus sinensis)。

3、本发明还提供了醇酰基转移酶在制备丁酸丁酯中的应用。

4、进一步地，本发明提供的质粒，还包括：标签蛋白；所述标签蛋白包括：sumo标签蛋白、trxa标签蛋白和\或his标签蛋白。

5、另外，本发明还提供了工程菌株，包括：权利要求1或2所述的醇酰基转移酶编码基因或权利要求4或5所述的质粒，转入具有丁醇和丁酰辅酶a合成能力的大肠杆菌获得的工程菌株。

6、在本发明的具体实施例中，所述具有丁醇和丁酰辅酶a合成能力的大肠杆菌优选为：丁醇生产菌eb243(保藏号为cgmcc no.12191)。

7、最后，本发明最后提供了所述的工程菌株在制备丁酸丁酯中的应用。

8、本发明公开的高活性的醇酰基转移酶来源于甜橙，其催化生产丁酸丁酯的活性远高于已报道的其他来源的醇酰基转移酶。利用该酶及其编码基因，生物发酵法生产丁酸丁酯，具有原料可再生、无需额外添加丁酸或丁醇，发酵过程操作方便等优点。

技术特征：

1.醇酰基转移酶，其特征在于，所述醇酰基转移酶氨基酸序列具有如seq id no1所示的氨基酸序列。

2.依据权利要求1所述的醇酰基转移酶，其特征在于，所述醇酰基转移酶来源于甜橙(citrus sinensis)。

3.权利要求1或2所述的醇酰基转移酶在制备丁酸丁酯中的应用。

4.质粒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的醇酰基转移酶。

5.依据权利要求4所述的质粒，其特征在于，还包括：标签蛋白；

6.权利要求4或5所述的质粒在制备丁酸丁酯中的应用。

7.工程菌株，其特征在于，将权利要求1或2所述的醇酰基转移酶编码基因或权利要求4或5所述的质粒，转入具有丁醇和丁酰辅酶a合成能力的大肠杆菌获后得的工程菌株。

8.依据权利要求7所述的工程菌株，其特征在于，所述具有丁醇和丁酰辅酶a合成能力的大肠杆菌优选为：丁醇生产菌eb243。

9.权利要求7至8任一所述的工程菌株在制备丁酸丁酯中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域。本发明公开了一种醇酰基转移酶，所述醇酰基转移酶氨基酸序列具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。本发明公开的高活性的醇酰基转移酶来源于甜橙，将其在具有丁酰辅酶A和丁醇合成能力的菌株中表达，能催化合成丁酸丁酯。该生物发酵法生产丁酸丁酯，具有原料可再生、无需额外添加丁酸或丁醇，发酵过程操作方便等优点。

技术研发人员：张延平,张天瑞,李寅
受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16