一种FAdV-4/FAdV-8b/FAdV-11三重荧光定量PCR检测的引物组和探针、试剂盒、构建方法

本发明涉及病毒检测，尤其涉及一种fadv-4/fadv-8b/fadv-11三重荧光定量pcr检测的引物组和探针、试剂盒、构建方法。

背景技术：

1、禽腺病毒(fowl adenovirus，fadv)为腺病毒科禽腺病毒属成员，根据群特异性抗原可将禽腺病毒分为ⅰ、ⅱ、ⅲ三个群，其中ⅰ群禽腺病毒可根据限制性酶切图谱分为a、b、c、d、e五个种，根据血清交叉中和试验又可将fadv-ⅰ分为12个血清型(fadv-11，fadv-8a，fadv-8b至fadv-11)。其中，目前国内较为流行的有fadv-4、fadv-8b以及fadv-11；禽腺病毒为无囊膜包裹的双链dna病毒，病毒粒子呈球形，直径约为70～90nm；病毒粒子呈二十面体对称结构，主要结构蛋白有六邻体蛋白(hexon)、五邻体蛋白(peton)以及纤维蛋白(fiber)。其中六邻体蛋白具有主要属和亚属的特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，因此该蛋白有一段区域与病毒中和和血清型特异性有关，为血清型诊断的主要依据。

2、18世纪末，禽腺病毒开始出现并逐渐在全球多个国家流行，2012年，我国也开始出现禽腺病毒病例，2013年报道逐渐增多，2015年于我国呈爆发性流行。禽腺病毒感染以后，发病率迅速，死亡率高，极易引起混合感染，给养禽业造成极大的经济损失。ⅰ群禽腺病毒主要引起鸡群出现包涵体肝炎(ibh)、肝炎-心包积水综合征(hhs)，肌胃糜烂(ge)等。发病鸡通常表现为食欲不振、贫血、羽毛杂乱、鸡冠颜色变浅等症状。目前，我国较为流行的毒株有fadv-4、fadv-8b以及fadv-11。

3、fadv-4主要引起心包积液综合征(hhs)，病鸡精神萎靡不振、排黄绿色稀便，在3～5周龄突然死亡，发病1～2周死亡率逐渐下降，死亡率30％～90％，病理剖检可见心包蓄积淡黄色液体或胶冻样物质、肝脏肿大坏死典型症状。fadv-8b和fadv-11主要与包涵体肝炎(ibh)相关。此外，有少量报道在肌胃损伤中分离到fadv-8b。ibh主要发生于3～7周肉鸡，感染初期无明显症状，个别鸡会突然死亡，发病3～4天达到死亡高峰期，6～7天回归正常范围。病理剖检可见肝脏斑驳肿胀，肾脏肿胀苍白，心包可见少量淡黄色液体。

4、多重荧光定量pcr是在荧光定量pcr的基础上设计两组或两组以上的引物及探针，在同一体系中同时完成多个目标基因的扩增，并对其进行定量监测的方法。多对引物及探针的存在或形成二聚体而对pcr扩增及信号采集产生一定的影响，因此在建立多重荧光定量pcr时既要避免各引物及探针碱基之间的相互干扰，又要尽量避免选择的荧光基团所发射的光谱范围有交叉重合而对结果产生影响。

5、周红蕾、程淑琴、李佳鹏、刘涵、姚志兰、张蕾等人在《猫疱疹病毒ⅰ型、猫杯状病毒、支气管败血波氏杆菌多重荧光定量pcr检测方法的建立与应用》中提供了对多病毒的多重荧光定量pcr检测方法的建立方法，尽管上述病毒与血清型禽腺病毒i群有明显的区别，但仍不妨碍其对于多重荧光定量pcr检测方法这一领域的贡献，该方案先准备了对fhv-1、fcv和bb的遗传物质的提取，随后以上述遗传物质为模板，得到cdna并冷藏保存；

6、同时该方案根据已经公布的fhv-1、fcv和bb的序列保守区域，通过在线(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)分别设计得到fhv-1、fcv和fpv相对应的引物qfhv-tk-f/qfhv-tk-r，qfcv-vp1-f/qfcv-vp1-r，qbb-dnt1-f/qbb-dnt1-r，同时设计了相对应的探针qfhv-tk-p、qfcv-vp1-p、qbb-dnt1-p，随后通过相对各引物的最适反应温度进行筛选，并按照最佳反应温度进行了大体系的pcr扩增，再通过矩阵法筛选多重定量pcr的引物和探针用量，最后筛选并确定最佳反应体系；

7、在确定最佳反应体系后，作者对猫疱疹病毒ⅰ型、猫杯状病毒、支气管败血波氏杆菌多重荧光定量pcr检测的灵敏度、标准曲线、特异性等进行了测试；在该文献中，其对fhv-1、fcv和bb的最低检出限分别达到10、10、100拷贝，并且具有极高的特异性。

8、可以看到，该方案公开了如何通过矩阵法确定最佳的反应体系和反应温度，并且与此同时，该方案也给出了可以通过(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)对引物和探针进行在线设计，但遗憾的是，该文献并未过多地提及如何筛选和搭配上述网站设计得到的多组引物和探针。

9、中国专利申请201711094956.2公开了一种区分四种血清型禽腺病毒i群的纳米多重pcr方法，该方法根据genbank公布的4、8a、8b和11型禽腺病毒i群六邻体基因序列，设计合成各型特异性引物；提取基因后进行纳米多重pcr扩增，pcr反应条件为95℃预变性5min，94℃，30s，53℃退火1min，72℃1min49s，30个循环；72℃延伸10min；纳米多重pcr扩增反应结束后，取pcr产物，以dl2000为maker，1％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小，确定病毒的血清型；

10、同时，该方案设计了分别用于检测4、8a、8b和11型禽腺病毒i群的4型禽腺病毒i群引物f、4型禽腺病毒i群引物r、8a型禽腺病毒i群引物f、8a型禽腺病毒i群引物r、8b型禽腺病毒i群引物f、8b型禽腺病毒i群引物r、11型禽腺病毒i群引物f、11型禽腺病毒i群引物r；通过上述引物对4、8a、8b和11型禽腺病毒i群进行扩增，再通过扩增片段的长度确定病毒的血清型，进而区分四种血清型禽腺病毒i群。

11、通过上述方案可见，关于针对4、8b和11型禽腺病毒i群即(fadv-4/fadv-8b/fadv-11)的引物设计，可以通过genbank公布的禽腺病毒i群六邻体(hexon)基因序列设计得到；事实也的确如此，本领域的技术人员的确可以通过genbank公布的hexon基因序列通过软件如primer premier 5生成可以针对fadv-4、fadv-8b、fadv-11的hexon保守区域基因序列的引物，但尽管primer premier 5软件可以生成上述的引物以及探针，可实际情况是，软件所提供的引物、探针并不唯一，并且尽管软件所提供的引物和探针均能够用于检测fadv-4、fadv-8b、fadv-11，但是，实际使用过程中，引物和探针的灵敏度、准确性等都有明显的差异，也就是说，软件可以为本领域的技术人员提供多种针对fadv-4、fadv-8b、fadv-11的hexon保守区域基因序列的引物、探针，但多种引物、探针之间对fadv-4、fadv-8b、fadv-11的检测能力却参差不齐；

12、另一方面，由于fadv-4、fadv-8b、fadv-11同属禽腺病毒i群，即使三者的部分hexon基因序列存在有特异性，但是仍不能避免三者的hexon基因序列存在相同序列的基因片段，因此，通过软件提供的引物、探针很容易出现错检的现象，即通过引物、探针检测到了fadv-4、fadv-8b、fadv-11中任意两者甚至三者的序列相同hexon基因序列；

13、而同时筛选出三组具有极佳的能够分别检测fadv-4、fadv-8b、fadv-11的引物和探针，并保证三组引物探针之间不会互相影响，造成错检现象的发生，这是极为不易的，这并不是简单地通过软件设计引物、探针，再将引物探针组合就能够完成的，实际操作过程中，我们需要对多组引物、探针进行初步筛选，保证其具有较高的检测能力，并且，即便如此，我们仍不能保证筛选出的多组引物、探针之间是否会相互影响，因此，我们还要进一步地考察筛选出的引物、探针，以避免错检的发生，综上所述，我们更想说的是，取得能够分别检测fadv-4、fadv-8b、fadv-11的引物、探针，这对于本领域的技术人员而言，的确是一件容易完成的事，但同时获得三组具有极强检测能力，却又不相互影响的引物和探针的组合却不是一朝一夕便可完成的，其中的筛选过程极为繁琐、复杂。

14、本方案需要解决的问题：如何提供一种兼具良好的特异性、灵敏度的fadv-4/fadv-8b/fadv-11三重荧光定量pcr检测引物和探针。

技术实现思路

1、本技术的目的是提供一种兼具良好的特异性、高灵敏度的fadv-4/fadv-8b/fadv-11三重荧光定量pcr检测引物和探针

2、本技术不作特殊说明的情况下：nm代表纳摩尔/升，μm代表微摩尔/升，mm代表毫摩尔/升，m代表摩尔/升；

3、为实现上述目的，本技术公开了一种fadv-4/fadv-8b/fadv-11三重荧光定量pcr检测的引物组和探针，包括用于检测fadv-4的第一引物组和第一探针、用于检测fadv-8b的第二引物组和第二探针、用于检测fadv-11的第三引物组和第三探针；

4、所述第一引物组包括引物fadv-4qf、引物fadv-4qr；

5、所述引物fadv-4qf的序列如seq id no：1；

6、所述引物fadv-4qr的序列如seq id no：2；

7、所述第一探针为probe4，其序列如seq id no：3；

8、所述第二引物组包括引物fadv-8bqf、引物fadv-8bqr；

9、所述引物fadv-8bqf的序列如seq id no：4；

10、所述引物fadv-8bqr的序列如seq id no：5；

11、所述第二探针为probe8b，其序列如seq id no：6；

12、所述第三引物组包括引物fadv-11qf、引物fadv-11qr；

13、所述引物fadv-11qf的序列如seq id no：7；

14、所述引物fadv-11qr的序列如seq id no：8；

15、所述第三探针为probe11，其序列如seq id no：9。

16、优选地，第一引物组、第一探针根据fadv-4的hexon片段的保守区域的核苷酸序列设计得到；

17、所述第二引物组、第二探针根据fadv-8b的hexon片段的保守区域的核苷酸序列设计得到；

18、所述第三引物组、第三探针根据fadv-11的hexon片段的保守区域的核苷酸序列设计得到。

19、此外，本技术还公开了一种fadv-4/fadv-8b/fadv-11三重荧光定量pcr检测试剂盒，包含第一引物组、第一探针、第二引物组、第二探针、第三引物组、第三探针。

20、优选地，所述试剂盒还包含反应混合液和ddh2o。

21、优选地，对fadv-4的最低检测限度为1.02×101copies/μl，对fadv-8b的检测限度为9.09×101copies/μl，对fadv-11的检测限度为8.58×102copies/μl

22、此外，本技术还公开了一种用于构建fadv-4/fadv-8b/fadv-11三重荧光定量pcr检测试剂盒的构建方法，包括以下步骤：

23、步骤1：分别根据fadv-4、fadv-8b、fadv-11的hexon片段的保守区域的核苷酸序列设计第一引物组、第一探针、第二引物组、第二探针、第三引物组、第三探针；

24、步骤2：使用第一引物组、第二引物组、第三引物组分别对fadv-4、fadv-8b、fadv-11进行扩增；

25、步骤3：使用矩阵法，确定三重荧光定量pcr检测的反应体系、反应条件。

26、优选地，所述反应体系的总体积为20μl；

27、反应体系具体包括：引物fadv-4qf的添加量为1μl、引物fadv-4qr的添加量为1μl、第一探针probe4的添加量为0.5μl；

28、引物fadv-8bqf的添加量为1μl、引物fadv-8bqr的添加量为1μl、第二探针probe8b的添加量为0.5μl；

29、引物fadv-11qf的添加量为1μl、引物fadv-11qr的添加量为1μl、第三探针probe11的添加量为0.5μl；

30、mix添加量为10μl；

31、ddh2o的添加量为1.5μl。待测样品1μl

32、优选地，所述反应条件为：37℃污染消化2min，95℃预变性5min，95℃循环反应10s，共40个循环，56℃退火30s，72℃延伸1min。

33、本技术的有益效果是：

34、本技术通过软件primer premier 5设计得到多组针对fadv-4、fadv-8b、fadv-11的引物和探针，并且通过反复多次的筛选，得到了三组兼具良好的特异性、高灵敏度且又不产生相互干扰的引物及探针，并且根据矩阵法，确定fadv-4/fadv-8b/fadv-11三重荧光定量pcr的最佳反应体系和反应条件，得到了一种具有良好特异性、灵敏度的fadv-4/fadv-8b/fadv-11三重荧光定量pcr检测试剂盒，同时，该试剂盒由于各引物和探针之间不会相互干扰，极大程度地降低了错检、漏检等现象的发生。