小于380个氨基酸的超级迷你型基因编辑器及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程，尤其涉及小于380个氨基酸的超级迷你型基因编辑器及其应用。

背景技术：

1、基因编辑技术是指对基因进行靶向修饰（敲除、插入、替换等）而获得新的特征或功能的技术，从第一代dna核酸酶编辑系统zfns、第二代talens到第三代crispr/cas9系统，以及以crispr/cas9为基础的be（base editing）系统和pe（prime editing）系统，基因编辑效率不断提高、编辑类型不断丰富，成本逐渐降低，应用范围不断扩大，已经深入广泛地用于了医疗、农业、能源、材料与环境等领域，并已经有不少的相关基因编辑产品上市，而更多的产品正在临床试验或者上市前准备之中。特别重要的是，基因编辑为人体细胞或组织及其他生命体的遗传改造和基因治疗提供了前所未有的强大工具，这将为整个生物产业带来巨大的革命性发展机遇。

2、早期研究发现，crispr/cas9系统来源于细菌和古细菌的天然获得性免疫系统，通过crispr rna (crrna)和trans-activating crrna (tracrrna)以及cas9蛋白组成的复合体抵御外源性dna的入侵。2012年crispr/cas9的体外重构和2013年在人类细胞中证明了其基因编辑功能，标志着新一代基因编辑时代的开始，随后此技术成功的在不同类型的细胞及动植物多个物种中行使基因编辑功能。但crispr/cas9与zfns和talens一样，都是在基因组靶标位点引起dna双链断裂，进而激活细胞内部修复机制的基础上实现编辑的。细胞内dna双链断裂的修复机制包括易引起随机插入、缺失的异源末端连接和需要同源模板存在才可以激活的同源重组修复。但是异源末端连接容易引起随机插入，进而影响靶基因的功能及基因组稳定性；同源重组（hdr）尽管精确性高于末端连接（nhej），但是其在细胞中的同源重组修复效率低，约为0.1%~5%，这些都大大限制了精确基因编辑技术的应用。随后针对上述缺陷，2016年4月，美国哈佛大学david liu实验室开发了不需要依赖dna双链断裂即可进行单碱基转换的基因编辑技术——be技术。该技术基于无核酸酶活性的dcas9(inactive or dead cas9) 或有单链dna切口酶活性的cas9n (cas9 nickase)、胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖基化酶抑制子(uracil dna glycosylase inhibitor, ugi) 以及sgrna形成的复合体，在不引起双链dna断裂的情况下，直接使靶向位点的胞嘧啶(cytosine, c)脱氨基变成尿嘧啶(uracil, u)；由于尿嘧啶糖基化酶抑制子的存在，抑制了u的切除；随着dna复制，u被胸腺嘧啶(thymine, t)取代；同时，互补链上原来与c互补的鸟嘌呤(guanine,g)将会替换为腺嘌呤(adenine, a)，最终实现了在一定的活性窗口内c-t和g-a的单碱基精准编辑。随后2017年，基于e. coli tada (ectada)的新型单碱基编辑器——腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors, abes)，实现了a.t碱基对向g.c碱基对的转换。随后国内外科学家又对be技术进行扩展，陆续开发了gcbe及双be等编辑器，并且上述各种be编辑器在不同类型细胞及不同的动植物物种都成功应用。但是这些研究主要用于部分类型的单碱基突变，不能实现其他类型的精确突变，比如任意类型的点突变，精确的删除和插入等等。2019年，david r. liu实验室开发了pe（prime editing）编辑系统，该系统不仅可以引入插入和缺失（indels），还可以实现12种碱基之间的任意转换。该系统的工作原理是：sgrna被改造成pegrna（prime editing guide rna），pegrna包含引物结合位点(primer bindingsite, pbs)区域；还携带着逆转录的模板序列，可以和逆转录酶（rt）相结合，而pegrna序列引导将其带入到目标基因序列中实现基因编辑。随后国内外课题组对pe细胞进行各方面优化，比如提高效率，删除和插入的片段增大等等，而且此技术成功在各种常用的细胞，小鼠，斑马鱼等模型动物以及许多植物中成功应用，但目前在原代细胞中编辑效率很低，而且在大动物的细胞和个体水平都未有成功报道，更重要的是pe系统与be系统类似，都因为其自身体量过大，从而限制其在aav基因治疗系统中广泛应用，而这恰是人类基因治疗的核心关键所在。

3、针对上述cas9，以及基于其发展的be系统和pe系统，显著弱点是元件过大，造成细胞转染或者投递效率低，从而限制了其应用范围，特别重要的是由于编辑器分子量巨大，远远超过aav基因治疗系统的承载量(小于4.7kb)，因此限制了上述这些基因编辑作为药物或者治疗手段以及体内外细胞遗传修饰的应用。当前编辑器过大的原因主要是cas9这个底盘核心工具分子量过大，达到了1368个氨基酸之多，以此为基础融合其他功能域（domain）构建的be和pe系统进一步增大分子量，而这个问题不可能从底盘解决。因此国内外多个课题组，开始通过寻找新的底盘cas系统的小型酶，以发展新的编辑工具。目前主要有casmini(557aa)、ascas12f1 (422aa)、ogeuiscb (499aa)和spcas12f (497aa)，但是其效率远低于cas9 (平均只有2%左右)，且很多研究仅限于细胞水平，很少扩展到动植物研究及基因治疗研究。同时这些小型酶虽然比cas9酶(1368aa)小，但还不足以小到可以融合不同domain以用于未来各种应用，重要的是截至目前为止，全球还未有小于380个aa的新型编辑器的报道。

4、2021年nature报道发现了一个新的小型的tnpb编辑工具，认为是cas12系统的祖先，而且仅有408个aa，但此报道仅仅在293t细胞中做了靶点的验证，截至目前，尚未见到此编辑工具在其他类型细胞和动物水平的研究报道。2023年王皓毅等人在nature上又报道了从64个注释的is605成员中筛选获得的25个在大肠杆菌中活跃的tnpbs，通过进一步研究后获得369个氨基酸和382个氨基酸的编辑器isaam1和isymu1，但是该基因编辑器的长度仍然较长。

5、因此，开发出更小且效率高的基因编辑器，仍然是当前基因编辑研发领域的核心关键任务。

技术实现思路

1、本发明通过对tnpb编辑器进行功能域精简的工程化操作，系统开发了小于380个aa的超级迷你型编辑器，命名为supermini-ge-swl，并且经过验证发现其在不同类型的哺乳细胞中可以实现高效的基因编辑，效率在10%-60%中间，平均达到了20.74%，远远高于原始tnpb及其他小型基因编辑器。同时，本发明将超级迷你型基因编辑器应用于基因编辑小鼠，并获得了巨大的成功，证明了本发明的超级迷你型基因编辑器，可以高效实现从哺乳类动物细胞到活体动物的精准编辑，解决目前基因编辑器较大的技术缺陷。

2、本发明的基因编辑器的开发策略包括如下步骤：

3、（1）解析基因编辑器元件结构，确定基因编辑核心功能区及非核心功能区，对非核心功能区进行区域截短，构建不同截短体类型的基因编辑器突变体；

4、（2）对基因编辑器突变体进行细胞水平和/或个体水平基因编辑效率的验证。

5、基于此，本发明提出如下技术方案。

6、首先，本发明提供了一种基因编辑器，其具有以下至少一种氨基酸序列：

7、seq id no.1所示氨基酸序列的第1~379位、第1~378位、第1~377位、第1~376位、第1~375位的氨基酸序列。

8、优选地，所述基因编辑器包括上述氨基酸序列以及功能蛋白；或包括上述氨基酸序列以及多肽。

9、所述功能蛋白或多肽与上述氨基酸序列连接后，不会影响上述氨基酸序列的活性（与导向rna结合的活性、核酸内切酶活性、在导向rna引导下与靶序列特定位点结合并切割的活性等）。

10、通过连接功能蛋白或多肽功能性元件后，能够赋予上述氨基酸序列更广泛的应用。如将其与核定位信号序列连接，可以提高本发明的蛋白进入细胞核的活性；与细胞修复机制关键调控因子连接，可以通过调控体内修复机制，提高特定修复所占比例。

11、优选地，所述功能蛋白或多肽选自以下至少一种：表位标签、报告基因序列、核定位信号序列、穿膜肽、靶向部分、转录激活结构域、转录抑制结构域、核酸酶结构域或者具有特定活性的结构域；所述特定活性包括：核苷酸脱氨酶、甲基化酶活性、去甲基化酶、转录激活活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸酶活性、单链rna切割活性、双链rna切割活性、单链dna切割活性、双链dna切割活性或者核酸结合活性。

12、在具体实施过程中，表位标签为本领域技术人员所熟知的，包括但不限于his、v5、flag、ha、myc、vsv-g、trx等。本领域技术人员根据期望目的(例如，纯化、检测或示踪)可以选择合适的表位标签。

13、在具体实施过程中，报告基因序列为本领域技术人员所熟知的，包括但不限于gst、hrp、cat、gfp、hcred、dsred、cfp、yfp、bfp等。

14、在具体实施过程中，核定位信号序列（nls）包含1个或多个nls序列。所述核定位信号序列位于、靠近或接近本发明的基因编辑器的末端(例如，n端或c端)。

15、在具体实施过程中，所述穿膜肽包括但不限于tat，cpp5等，以增加本发明基因编辑器穿透细胞膜的能力。

16、进一步，本发明提供了编码上述基因编辑器的核酸。

17、在具体实施过程中，所述核酸可以经过密码子优化用于在原核细胞或真核细胞中的表达。

18、进一步，本发明提供了一种复合物，包括蛋白组分和核酸组分；

19、所述蛋白组分为上述基因编辑器；

20、所述核酸组分中含有ttgat/tttat特征以及能够与靶序列杂交的导向序列；

21、和/或，所述核酸组分中含有导向rna的核苷酸序列。

22、蛋白组分和核酸组分能够相互结合形成复合物。

23、蛋白组分和核酸组分可以是天然存在的，也可以是经过修饰的。

24、在一些实施方案中，靶序列是非天然存在的dna或rna序列。

25、在具体实施过程中，当靶序列为dna时，所述靶序列位于原间隔序列临近基序(tam)的5’端。

26、在一些实施方案中，靶序列存在于细胞内。

27、在一些实施方案中，靶序列存在于细胞核内或细胞质(如细胞器)内。

28、优选地，所述细胞为原核细胞。

29、进一步，本发明提供了一种生物材料，其中含有上述基因编辑器、或核酸、或复合物，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞、转基因细胞系或重组微生物。

30、优选地，所述宿主细胞包括不能繁殖为植物或动物个体的细胞，所述转基因细胞系包括不能繁殖为植物或动物个体的细胞。

31、在具体实施过程中，所述载体为克隆载体或表达载体。所述载体能够表达上述基因编辑器、或编码基因编辑器的核酸、或上述复合物。所述载体包括但不限于质粒、噬菌体、柯斯质粒。

32、在具体实施过程中，宿主细胞包括但不限于原核细胞（例如大肠杆菌细胞）、真核细胞（例如酵母细胞）、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞（例如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞或人细胞）。宿主细胞还可以是细胞系，例如293t细胞系。

33、进一步，本发明提供了一种递送组合物，其中含有递送载体以及以下至少一种组分：上述基因编辑器、核酸、复合物、生物材料。

34、优选地，所述递送载体为以下至少一种：脂质颗粒、糖颗粒、金属颗粒、蛋白颗粒、脂质体、外泌体、微泡、基因枪载体、病毒载体（例如复制缺陷型逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒）。

35、本发明的递送组合物可以通过本领域已知的任何方法进行递送，包括但不限于电穿孔、脂转染、核转染、显微注射、声孔效应、基因枪、磷酸钙介导的转染、阳离子转染、脂质体转染、树枝状转染、热激转染、核转染、磁转染、脂转染、穿刺转染、光学转染、试剂增强性核酸摄取、经脂质体、免疫脂质体、病毒颗粒、人工病毒体等载体递送。

36、进一步，本发明提供了一种药品，其中含有以下至少一种组分：上述基因编辑器、核酸、复合物、生物材料、递送组合物。

37、优选地，所述药品中还包括药学上可接受的辅料。

38、所述药品包括但不限于用于基因编辑。

39、进一步，本发明提供了一种试剂或试剂盒，其中含有以下至少一种组分：上述基因编辑器、核酸、复合物、生物材料、递送组合物。

40、本发明的试剂或试剂盒中包含的组分可以被提供于任何适合的容器中。

41、在一些实施方案中，所述试剂或试剂盒中还包含一种或多种缓冲液。缓冲液可以是任何缓冲液，包括但不限于碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、tris缓冲液、mops缓冲液、hepes缓冲液及其组合。

42、在一些实施方案中，所述试剂或试剂盒中还包含一个或多个寡核苷酸，该一个或多个寡核苷酸对应于一个用于插入进载体中的导向序列，以便可操作地连接该导向序列和调节元件。

43、在一些实施方案中，所述试剂或试剂盒包括同源重组模板多核苷酸。

44、进一步，本发明提供了上述基因编辑器、核酸、复合物、生物材料、递送组合物、药品、试剂或试剂盒在基因编辑中的应用。

45、在一些实施方案中，所述基因编辑为非诊断治疗目的。

46、优选地，所述基因编辑为真核生物的基因编辑。

47、所述真核生物包括但不限于人、猴子、小鼠、猪、牛、羊、兔子等。

48、进一步，本发明提供了一种靶基因的修饰方法，包括采用上述基因编辑器、核酸、复合物、生物材料、递送组合物、药品、试剂或试剂盒对靶基因进行修饰。

49、在一些实施方案中，所述靶基因的修饰方法用于非诊断治疗目的。

50、在具体实施过程中，将上述基因编辑器、核酸、复合物、生物材料、递送组合物、药品、试剂或试剂盒与靶基因接触进行修饰，或者递送至含有靶基因的细胞或胚胎中，靶序列存在于所述靶基因中。

51、在一些实施方案中，靶基因存在于胚胎或细胞中。

52、优选地，靶基因存在于真核细胞中，更优选存在于哺乳动物细胞中。所述哺乳动物细胞包括但不限于人类细胞，猴子细胞，非人灵长类动物、牛、猪或啮齿类动物细胞。

53、在一些实施方案中，所述细胞是非哺乳动物真核细胞，例如家禽或鱼等。

54、在一些实施方案中，所述细胞是植物细胞，例如栽培植物(如玉米、高粱、小麦或水稻)、藻类、树或蔬菜细胞。

55、在一些实施方案中，所述靶基因存在于体外的核酸分子(如质粒)中。

56、在一些实施方案中，所述方法导致靶基因中的靶序列断裂(如使dna双链断裂或rna单链断裂)。

57、在一些实施方案中，所述断裂导致靶基因的转录降低。

58、优选地，所述修饰方法还包括利用编辑模板(例如外源核酸)对靶基因进行编辑。

59、在具体实施过程中，将编辑模板与靶基因接触进行编辑，或者递送至含有靶基因的细胞或胚胎中进行编辑。

60、在一些实施方案中，所述方法通过与编辑模板(例如外源核酸)同源重组修复断裂的靶基因，其中修复导致一种突变，包括所述靶基因的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代。

61、在一些实施方案中，所述突变导致在从包含该靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸的改变。

62、在一些实施方案中，所述修饰还包括将编辑模板(例如外源核酸)插入断裂的靶基因中。

63、在一些实施方案中，所述修饰方法用于改变靶基因或编码靶基因产物的核酸分子中的一个或多个靶序列来修饰细胞、细胞系或生物体。

64、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

65、本发明首次开发了小于380个aa的超级迷你型基因编辑器，本发明的超级迷你型基因编辑器，可以高效实现从哺乳类动物细胞到活体动物的精准、高效编辑，具有极大的推广应用价值。