一种基于跨膜多肽的近红外成像miRNA的报告基因探针及其构建方法和应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针及其构建方法和应用。

背景技术：

1、微小rna(micrornas，mirnas)是一类短的非编码rnas，其通过抑制靶标信使rna的表达，在多种生理和病理过程中发挥重要调控作用。研究表明，许多mirnas在特定细胞或组织类型中表达，且其表达在不同的发育或疾病阶段发生动态变化。值得注意的是，mirnas的异常表达与多种人类疾病相关，如心脏病、肾脏疾病和神经系统疾病。此外，mirnas也被认为是多种癌症的生物标志物。以上特征使得mirnas成为多种人类疾病和肿瘤诊断的一种新生物学标记。因此，对体内mirna表达进行监测不仅有助于揭示mirnas功能，同时对于追踪疾病进展和肿瘤诊断非常有用。

2、近年来，研究者们通过人工合成基因线路开发出了一些萤光素酶或荧光蛋白报告系统，并借助生物发光或荧光成像技术，实现了在活体细胞中实时监测mirnas的表达变化情况。然而，这些系统所依赖的生物发光或传统荧光成像信号组织穿透性较差，这大大限制了其在体内的应用。相比之下，近红外荧光(near-infrared fluorescence，nirf)成像具有低背景、深层组织穿透性特点，在临床诊疗上展现出越来越明显的应用优势。因此，有必要开发一种可用于监测体内mirnas的近红外荧光成像系统，推动未来mirnas作为人类疾病和癌症生物标志物的临床转化。

3、吲哚菁绿(indocyanine green，icg)是一种可用于临床的近红外荧光染料，因其低毒性和近红外荧光发射而被广泛使用。近期研究表明，哺乳动物细胞可通过有机阴离子转运多肽oatp1b3将icg摄入细胞内，进而实现体内近红外荧光成像。由于icg的临床可用性，开发基于oatp1b3的近红外荧光系统有望在生物医学领域得到应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针及其构建方法和应用，解决现有mirna表达变化监测系统组织穿透力差的问题。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明公开了一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针，包括ts-laci-ts载体和laco2-oatp1b3载体；

4、所述ts-laci-ts载体为携带3xts序列、laci序列和3xts序列的载体；其中，所述3xts序列由目的mirna的靶序列重复若干次得到；

5、所述laco2-oatp1b3载体为携带laco2序列和oatp1b3序列的载体；其中，所述laco2序列由laco操纵子序列重复2次得到。

6、优选地，所述3xts序列由目的mirna的靶序列重复3次得到。

7、优选地，所述ts-laci-ts载体由连接的3xts序列、laci序列和3xts序列与线性化的pcl-neo载体重组得到；所述laco2-oatp1b3载体由连接的laco2序列和oatp1b3序列与线性化的pcl-neo载体重组得到。

8、优选地，连接的laco2序列和oatp1b3序列的核苷酸序列如seq id no.2所示。

9、优选地，当细胞中不存在目的mirna时，laci基因能够表达，然后结合到调控序列laco2上，从而在转录水平抑制oatp1b3的表达，此时icg染料只有本底水平被细胞摄取，输出荧光信号弱；当细胞中存在目的mirna时，目的mirna会结合到靶序列3xts上抑制laci基因的表达，从而解除对oatp1b3的抑制，icg染料被细胞大量摄取，输出荧光信号强。

10、优选地，当mirna为mir-21时，在ts-laci-ts载体中，连接的3xts序列、laci序列和3xts序列的核苷酸序列如seq id no.1所示。

11、本发明还公开了上述一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针的构建方法，包括以下步骤：

12、1)将目的mirna的靶序列重复若干次，得到3xts序列；将3xts序列、laci基因序列和3xts序列依次相连，得到核酸a片段；

13、2)将laco操作子序列重复2次得到laco2序列，将laco2、oatp1b3序列依次相连，得到b片段；

14、3)利用基因重组技术将a、b片段分别与线性化的载体重组，经大肠杆菌转化、质粒抽提后，获得ts-laci-ts载体和laco2-oatp1b3载体。

15、优选地，所述线性化的载体由nhei和noti酶切pcl-neo载体，线性化之后得到。

16、本发明还公开了上述一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针在监测mirna表达的动态变化中的应用。

17、本发明还公开了一种mirna表达变化监测系统，包括上述一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针和icg。

18、优选地，报告基因探针中，ts-laci-ts载体与laco2-oatp1b3载体的体积比为2:1。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、本发明构建了一种基于跨膜多肽oatp1b3的近红外成像监测mirna的报告基因探针，利用跨膜多肽oatp1b3介导细胞摄入近红外荧光染料icg的特点及mirna引导的mrna序列降解，为近红外成像监测细胞内mirna表达提供一种优良工具。当细胞中不存在目的mirna时，报告基因探针中的laci基因能够表达，然后结合到调控序列laco2上，从而在转录水平抑制oatp1b3的表达，此时近红外荧光染料icg只有本底水平被细胞摄取，输出荧光信号弱；当细胞中存在目的mirna时，目的mirna会结合到报告基因探针中的靶序列3xts上抑制laci基因的表达，从而解除对oatp1b3的抑制，红外荧光染料icg被细胞大量摄取，输出高荧光信号。该探针为监测活体mirna的动态变化提供了一种技术手段，同时为解决现有mirna体内成像探针的信号组织穿透力差提供了一种新策略。本发明构建的体内mirnas近红外荧光成像检测探针为克服基础研究和临床应用之间的脱节问题提供了新思路，有望推动未来mirnas作为人类疾病和癌症诊断生物标志物的临床转化。

技术特征：

1.一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针，其特征在于，包括ts-laci-ts载体和laco2-oatp1b3载体；

2.根据权利要求1所述的一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针，其特征在于，所述ts-laci-ts载体由连接的3xts序列、laci序列和3xts序列与线性化的pcl-neo载体重组得到；所述laco2-oatp1b3载体由连接的laco2序列和oatp1b3序列与线性化的pcl-neo载体重组得到。

3.根据权利要求1所述的一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针，其特征在于，连接的laco2序列和oatp1b3序列的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4.根据权利要求1所述的一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针，其特征在于，当细胞中不存在目的mirna时，laci基因能够表达，然后结合到调控序列laco2上，从而在转录水平抑制oatp1b3的表达，此时icg染料只有本底水平被细胞摄取，输出荧光信号弱；当细胞中存在目的mirna时，目的mirna会结合到靶序列3xts上抑制laci基因的表达，从而解除对oatp1b3的抑制，icg染料被细胞大量摄取，输出荧光信号强。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针，其特征在于，当mirna为mir-21时，在ts-laci-ts载体中，连接的3xts序列、laci序列和3xts序列的核苷酸序列如seq id no.1所示。

6.权利要求1～5任意一项所述的一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针的构建方法，其特征在于，所述线性化的载体由nhei和noti酶切pcl-neo载体，线性化之后得到。

8.权利要求1～5任意一项所述的一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针在监测mirna表达的动态变化中的应用。

9.一种mirna表达变化监测系统，其特征在于，包括权利要求1～5任意一项所述的一种基于跨膜多肽的近红外成像mirna的报告基因探针和icg。

技术总结
本发明公开了一种基于跨膜多肽的近红外成像miRNA的报告基因探针及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。所述的探针包括pCl‑neo载体、核酸A片段和核酸B片段。所述的核酸A片段和核酸B片段分别与线性化的pCl‑neo载体重组，核酸A片段由3xTS、LacI、3xTS序列依次连接组成，核酸B片段由LacO2和OATP1B3组成。该报告基因分子影像探针中，目标miRNA通过负调控LacI基因表达，激活跨膜多肽OATP1B3表达。OATP1B3能够介导细胞摄入近红外荧光染料ICG，因此该报告基因探针可以用于近红外荧光成像监测活体miRNA的表达变化，为活体miRNA表达的动态变化提供一种实时、无创的监测工具。

技术研发人员：舒文杰,王福,马喆,田小杰
受保护的技术使用者：西安交通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/5