本发明涉及一种双熵驱动的对核酸分子进行荧光检测的方法及其应用，属于分析化学和生物医学。
背景技术：
1、虽然目前已经有多种肿瘤治疗手段，肿瘤的治疗仍然面临严峻的挑战。其主要原因在于肿瘤初期症状不明显，受限于当前的成像技术，多数肿瘤发现时往往已经进展到中后期，治疗难度显著升高。我国迫切需要开发有效的肿瘤早期诊断技术，早发现早干预，提升癌症治疗效果和患者的平均生存率，为人民健康保驾护航。
2、mirna是小的非编码rna，在细胞生物学的各个方面都起着关键作用，包括细胞周期，血管生成，大脑发育和认知过程。大多数mirna在人体组织中普遍表达，而一些特殊mirna仅在一个或几个组织中富集，并由组织特异性因子严格控制表达。mirna表达的失调，无论是上调或下调，都可能导致细胞功能并发症，从而导致癌症、心血管疾病和神经系统疾病等。因此，mirnas可以被视为特定或一组疾病的特异性生物标志物。
3、目前常用的mirna检测技术主要有以下几种：northern blotting、微阵列芯片、pcr和生物传感技术等。其中生物传感器具有高灵敏度、高特异性、检测过程简便和易于小型化的特点，已被广泛应用于各种肿瘤标志物的检测分析中，结合多种信号放大技术，传感器的检测灵敏度可以进一步提升。熵驱动催化(entropy driven catalysis，edc)策略于2007年首次提出，利用反应体系中的熵增加驱动反应过程，通过toehold介导的分支迁移和链位移再生实现扩增。与其他非聚合酶依赖型的核酸扩增技术相比，该技术设计更为简便，检测快速，具有更好的检测性能。但目前的熵驱动扩增仅为单熵增体系，反应过程无法实现完全的自动化过程，需要人为添加燃料链推动反应的进程。
4、因此提出本发明。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明通过熵驱动扩增系统的独特设计，建立了一种基于双熵驱动的荧光纳米生物传感方法，用于mirna-21的高灵敏、高特异性和准确检测，并在此基础上实现mirna-21的胞内成像。
2、本发明的第一个目的是提供一种双熵驱动的对核酸分子进行荧光检测的方法，包括以下步骤：
3、s1、将金纳米颗粒分别与序列c、序列f孵育使金纳米颗粒与序列共价连接，再对金纳米颗粒进行封闭处理避免非特异性吸附，得到aunps-c和aunps-f；其中，序列c上设有相连的序列1’、序列2’、序列3’和序列4’，序列f上设有相连的序列5’、序列2’、序列3’和序列4’；
4、s2、将序列a、序列b与s1得到的aunps-c共孵育，得到aunps-abc，将序列d、序列e与s1得到的aunps-f共孵育，得到aunps-def；其中，序列b上设有相连的序列5、序列2和序列3，序列e上设有相连的序列1、序列2和序列3，序列a上设有序列1，序列d上设有序列5；
5、s3、将不同浓度的核酸靶标样品与s2得到的aunps-abc、aunps-def共孵育，反应结束后检测荧光强度；其中，核酸靶标上设有相连的序列3和序列4；
6、s4、建立荧光强度与核酸靶标浓度之间的关系曲线；
7、s5、将待检测样品按照s1-s3步骤进行操作，测定出荧光强度，根据s4步骤荧光强度与核酸靶标浓度之间的关系曲线，计算出待检测样品中的核酸靶标的含量；
8、其中，序列a和序列d上修饰有荧光基团，序列1-5分别与序列1’-5’反向互补，序列1与序列5的长度相等且两者不互补。
9、进一步地，序列2的长度为4nt，序列5的长度为15nt，序列4的长度为6nt。
10、进一步地，所述序列1的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述序列2的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述序列5的核苷酸序列如seq id no.12所示。
11、进一步地，当所述核酸靶标为mirna-21时，序列3的核苷酸序列如seq id no.10所示，序列4的核苷酸序列如seq id no.11所示。
12、进一步地，序列c和序列f为3’端修饰巯基的dna序列。
13、进一步地，序列b从5’端到3’端依次为序列5、2、3，序列c从5’端到3’端依次为序列4’、3’、2’、1’，序列e从5’端到3’端依次为序列1、2、3，序列f从5’端到3’端依次为序列4’、3’、2’、5’。
14、进一步地，待测样品可为含有核酸的溶液，也可为含有核酸的细胞。
15、进一步地，当待测样品为含有核酸的溶液时，核酸的浓度为5pm～25nm。
16、进一步地，pbs缓冲液配方：137mm nacl,2.7mm kcl,ph 7.4。
17、进一步地，在步骤s3的反应过程中，序列b和序列e先分别从aunps-abc、aunps-def中游离出来，形成aunps-ac、b、aunps-df、e的混合物，然后在熵驱动下，序列b与aunps-df结合使序列d游离出来，序列e与aunps-ac结合使序列a游离出来，序列a和序列d上的荧光基团重新发光。
18、本发明的检测原理为：自由能的计算公式为delta g＝delta h-t*delta s，由于反应前后碱基对和链的总数保持一致，反应过程中delta h趋近于0，因此反应过程中的能量来源于反应中的熵变化(delta s)，该自由能变化驱动本发明检测体系的双熵增。具体地，
19、首先使用含有tcep的溶液对巯基修饰的序列c和序列f中的二硫键进行还原。将还原后的序列c和序列f溶液分别加入两组aunps中孵育，序列通过au-s键连接到aunps表面。使用mch对aunps-c和aunps-f表面多余位点进行封闭，避免dna的非特异性吸附作用。向aunps-c中加入序列a和序列b，aunps-f中加入序列d和序列e，序列a和b通过与序列c互补而与aunps-c相连，序列d和e通过与序列f互补与aunps-f连接。将制备完成的aunps-abc和aunps-def离心清洗后混匀。当mirna-21存在的情况下，序列b和序列e被置换，释放到溶液中。随后序列b和序列e被回收作为cyclic reaction b和cyclic reaction a的燃料链，推动靶循环反应的进行。序列b与序列f结合后将目标mirna和信号分子序列d置换，目标mirna通过靶标循环继续发生反应，信号分子d从aunps表面脱落，荧光信号恢复。序列e的反应过程与序列b一致(图1)。最后，建立荧光信号与mirna-21浓度的线性关系，利用该标准曲线计算样品中的mirna-21含量(图2)。
20、本发明的第二个目的是提供一种双熵驱动的检测核酸分子的荧光纳米生物传感器，包括：
21、序列a，所述序列a上设有序列1，且序列a上修饰有荧光基团；
22、序列b，所述序列b上设有相连的序列5、序列2和序列3，序列5与序列1的长度相等且两者不互补；
23、与金纳米颗粒连接的序列c，所述序列c上设有相连的序列1’、序列2’、序列3’和序列4’；
24、序列d，所述序列d上设有序列5，且序列d上修饰有荧光基团；
25、序列e，所述序列e上设有相连的序列1、序列2和序列3；
26、与金纳米颗粒连接的序列f，所述序列f上设有相连的序列5’、序列2’、序列3’和序列4’；
27、其中，序列1-5分别与序列1’-5’反向互补，序列3的3’端与序列4的5’端相连，且连接后的序列与待测核酸分子序列相同。
28、进一步地，所述金纳米颗粒与序列c或序列f共价连接。
29、进一步地，所述金纳米颗粒与序列c或序列f通过au-s键连接。
30、进一步地，所述序列1的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述序列2的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述序列5的核苷酸序列如seq id no.12所示。
31、进一步地，当所述核酸靶标为mirna-21时，序列3的核苷酸序列如seq id no.10所示，序列4的核苷酸序列如seq id no.11所示。
32、进一步地，本发明中提供的荧光纳米生物传感器，其构建过程及mirna-21的测定应用如下：
33、(1)aunps-c和aunps-f制备
34、aunps-c的制备：取9μl 100μm序列c，30μl 1.5mm tcep，3μl 1mnacl与108μlddh2o混匀，置于25℃孵育1h。序列c溶液与150μl 20nm aunps溶液混匀，置-20℃孵育2h。为进一步稳定序列c与aunps的连接效果，将混合物取出后置于25℃摇床孵育4h。最后在溶液中添加6μl 200μmmch对aunps表面的多余位点进行封闭。
35、aunps-f的制备流程与aunps-c相同。
36、(2)aunps-abc和aunps-def制备
37、取aunps-c溶液于12000rpm离心15min，弃上清，使用ddh2o清洗沉淀3次。随后使用252μl ddh2o重新溶解沉淀，并向其中加入9μl 100μm序列a，9μl 100μm序列b和30μl0.01％ pvp，混匀。混合物随后置于37℃摇床孵育2h以制备aunps-abc溶液。
38、aunps-def的制备流程与aunps-abc相同。
39、将aunps-abc和aunps-def离心后清洗3次以去除未结合序列，最后将aunps-abc和aunps-def分别用1.5ml ddh2o重新溶解并保存于4℃以备后用。
40、(3)胞外mirna-21的测定
41、取50μl aunps-abc与50μl aunps-def混匀以制备100μl检测液。将100μl不同浓度的mirna-21加入检测液，混匀后置于37℃摇床孵育1h。通过biotek酶标仪读取荧光强度，设置激发波长为643nm，发射波长为667nm。
42、(4)胞内mirna-21成像
43、根据步骤(1)-(3)制备aunps-abc和aunps-def溶液。将制备好的aunps-abc和aunps-def离心后重新溶解在相同体积的培养基中。随后将aunps-abc和aunps-def溶液等比例混匀以制备胞内成像检测液。
44、在15mm激光共聚焦培养皿中培育待测细胞，令细胞贴壁，测定前使用pbs缓冲液清洗培养皿3次。向培养皿中重新加入0.5ml检测液，并将培养皿置于含37℃，5％co2的培养箱中孵育2h。使用pbs缓冲液清洗培养皿3次。随后向培养皿中加入0.5ml 4％多聚甲醛固定细胞15min。使用pbs缓冲液清洗培养皿3次。向培养皿中加入0.5ml dapi染料，孵育15min。最后使用激光共聚焦扫描显微镜拍摄细胞图片。设置dapi信号激发波长为405nm。发射波长范围420nm-460nm。cy5信号激发波长为605nm，发射波长为660-700nm。
45、本发明的第三个目的是提供上述荧光纳米生物传感器在制备核酸分子检测产品中的应用。
46、本发明的第四个目的是提供上述荧光纳米生物传感器在制备疾病诊断产品中的应用。
47、进一步地，所述疾病诊断产品用于检测癌症，尤其是用于检测其生物标志物。
48、进一步地，用于靶向成像。
49、本发明的有益效果：
50、本发明构建了一种基于双熵驱动的荧光纳米生物传感方法，用于核酸分子(本发明以mirna-21的检测为例)的高灵敏、高特异性检测。通过修饰在两组aunps表面的三链dna识别mirna-21，释放的序列b和序列e随后作为燃料链各自进入另一组aunps中，将信号分子a和d置换，荧光信号恢复。目标mirna脱离双链后与未发生反应的三链结构继续反应，实现靶标循环过程。构建的双熵驱动扩增系统无需在反应过程中外加燃料链，识别靶标后即可自发完成信号释放和信号扩增过程，大大简化了检测过程，降低检测成本，提高检测灵敏度。