一种黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法

本发明涉及生物鉴定，尤其涉及一种用于黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法。

背景技术：

1、在枸杞属分类群中，宁夏枸杞和黑果枸杞为国内商业栽培利用最广泛的两种，经济价值最大。通过研究发现，二者的部分野生群体有着不同程度的杂交现象，杂交子代在表型性状上和两个亲本有不同程度的相似性，但是由于杂交子代存在着果实较小，经济性状差的现象，因此在人工栽培中需要在苗期进行筛选和鉴定。

2、ssr分子标记也叫微卫星，是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，通常是一种用1-6个寡核苷酸组成的简单重复序列，其两端是保守的单拷贝序列，常用的手段是在序列的两端设计并连接一对特异性引物。ssr标记具有共显性的特点，大多数情况下微卫星在生物的基因组中分布，变异位点中包含很多遗传基因，这样的标记方法多态性稳定且重复率高，操作便利，灵敏度好。由于重复单位的重复次数在个体间高度变异，数量丰富，因此微卫星标记有广泛的应用性。利用ssr标记的方法可以对品种和种群之间的多样性进行评价的研究，也可以应用到遗传图谱的构建和种质的鉴定等方面。但目前该方法并未应用于黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种鉴定，对于黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定大多还是凭借个人经验进行判断，这导致准确性不高。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是针对现有技术的缺点，提供一种针对黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法。

2、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，其特征在于：按以下步骤进行：

3、1、ssr数据的获得和引物的设计：

4、设计若干对微卫星引物进行筛选，包括数量相同的黑果枸杞引物、黄果枸杞引物及宁夏枸杞引物，然后再分别选择黑果枸杞、杂交带枸杞和宁夏枸杞若干个dna样品对选取的引物进行pcr扩增；

5、通过对引物长度、产物长度以及tm值的额对比分析，对引物进行合成；

6、2、引物的验证：

7、2.1、叶片dna提取

8、通过改进的ctab法提取和纯化枸杞叶片基因组dna，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna的完整性；

9、2.2、扩增体系构建

10、根据紫外光谱分析法，紫外分光光度计测定dna模板的浓度和质量，用时将模板浓度稀释至20-40ng/μl；经测定，模板浓度约为100ng/μl，a260/a280为1.7-2.0，以满足ssr对模板质量的要求；

11、经过对复性温度和延伸温度与时间的梯度pcr，确定最终的ssr-pcr反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)54℃退火45s；(4)72℃延伸1min；(5)步骤(2)-(4)共循环40次；(6)72℃延伸7min；(7)4℃保存；

12、选取合成的引物以及dna模板进行体系筛选；

13、2.3、引物筛选

14、利用选择的pcr体系对生物合成的引物进行筛选，进而对若干若干个单株样本进行扩增；选择模板dna对所有引物进行筛选，最终得到若干对特异性良好的引物；

15、3、基于ssr进行黑果枸杞与宁夏枸杞杂交种的检测：

16、将筛选出的引物分别用若干个模板dna进行ssr分子标记，记录扩增后的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；

17、4、利用软件structure 2.3进行纯种和杂交种的鉴定

18、分析时不作数迭代设置为10000,不作数迭代后的mcmc设置为100000；设定不同的划分群体数目，即k值，为确定合适的类群数目，k取值从2到8，x是基因型，对多为点基因型数据进行对数运算，即lnp(x|k)，用来确定k值；

19、每一k值下运算若干次，用于计算δk，δk的计算是基于相邻k值的lnp(x|k)的差值,即δk＝m|l(k+1)-2l(k)+l(k)|/s|l(k)|，依据lnp(x|k)和δk的值确定合适的k值；在混合模型中，根据后验概率估算每一样品的基因来源及其比例，根据混合系数q来判定纯合体和杂合体，q的阈值为0.9；

20、5、种群数目k值的判断

21、在不输入任何物种信息的条件下，利用软件structure 2.3.1对各样品的ssr数据进行遗传结构及模型聚类分析；对δk进行计算，峰值在k＝3时出现，δk＝1.977，且远大于k＝5时的值0.731，而k＞3时，δk的值更小，均小于1；

22、6、获取杂交情况

23、根据structure软件的输出结果，以纵坐标为q值，横坐标为个体，q≥0.9的个体为纯合子，q＜0.9的个体为杂种；k＝3时共分为3个群体，黑果枸杞和宁夏枸杞，且两个亲本黑果枸杞和宁夏枸杞都有其他基因的存在。

24、根据测序得到的全基因组序列通过blast设计60对微卫星引物，即黑果枸杞引物r1-r20、黄果枸杞引物y1-y20和宁夏枸杞引物r1-r20，进行筛选：分别选择黑果枸杞、杂交带枸杞和宁夏枸杞共5个dna样品对选取的引物进行pcr扩增，并选取60对引物进行合成。

25、在步骤2.2中，pcr扩增反应总体积为20μl，引物浓度最终为10μmol/l。

26、在步骤2.3引物筛选时，利用选择的pcr体系对生物合成的60对引物进行筛选，进而对30个单株样本进行扩增；选择5个模板dna对所有引物进行筛选，最终得到25对特异性良好的引物。

27、在引物筛选的过程中，剔除没有任何条带和没有特异性条带的引物，筛选出25对重复性好、多态性强、条带清晰的引物。

28、在步骤3中，将筛选出的25对引物分别用30个模板dna进行ssr分子标记。利用筛选出的25对ssr引物分别对30个体进行分析，共检测到等位基因64个，每个位点的等位基因数从1到4个不等，平均等位基因数为2.56；其中，位点r8、r13、b5的等位基因数最高，为4个；位点b11的等位基因数最少，为1个；shannon多样性指数的变化范围是0-1.1407，平均值为0.5939，最大的为位点r13，最小的是位点b11，显示出不同位点对群体的基因多样性的贡献有差别。

29、本发明利用ssr标记具有共显性的特点，大多数情况下微卫星在生物的基因组中分布，变异位点中包含很多遗传基因，从而在鉴定宁夏枸杞和黑果枸杞杂交种的ssr标记的开发和应用中，达到多态性稳定且重复率高、操作便利、灵敏度好等效果。

技术特征：

1.一种黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，其特征在于：按以下步骤进行：

2.根据权利要求1所述的黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，其特征在于：根据测序得到的全基因组序列通过blast设计60对微卫星引物，即黑果枸杞引物r1-r20、黄果枸杞引物y1-y20和宁夏枸杞引物r1-r20，进行筛选：分别选择黑果枸杞、杂交带枸杞和宁夏枸杞共5个dna样品对选取的引物进行pcr扩增，并选取60对引物进行合成。

3.根据权利要求1所述的黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，其特征在于：在步骤2.2中，pcr扩增反应总体积为20μl，引物浓度最终为10μmol/l。

4.根据权利要求2所述的黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，其特征在于：在步骤2.3引物筛选时，利用选择的pcr体系对生物合成的60对引物进行筛选，进而对30个单株样本进行扩增；选择5个模板dna对所有引物进行筛选，最终得到25对特异性良好的引物。

5.根据权利要求4所述的黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，其特征在于：在引物筛选的过程中，剔除没有任何条带和没有特异性条带的引物，筛选出25对重复性好、多态性强、条带清晰的引物。

6.根据权利要求5所述的黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，其特征在于：在步骤3中，将筛选出的25对引物分别用30个模板dna进行ssr分子标记。

7.根据权利要求6所述的黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，其特征在于：利用筛选出的25对ssr引物分别对30个体进行分析，共检测到等位基因64个，每个位点的等位基因数从1到4个不等，平均等位基因数为2.56；其中，位点r8、r13、b5的等位基因数最高，为4个；位点b11的等位基因数最少，为1个；shannon多样性指数的变化范围是0-1.1407，平均值为0.5939，最大的为位点r13，最小的是位点b11，显示出不同位点对群体的基因多样性的贡献有差别。

技术总结
本发明公开了一种黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，通过对设计若干对微卫星引物进行筛选，包括数量相同的黑果枸杞引物、黄果枸杞引物及宁夏枸杞引物，然后再分别选择黑果枸杞、杂交带枸杞和宁夏枸杞若干个DNA样品对选取的引物进行PCR扩增，基于SSR进行黑果枸杞与宁夏枸杞杂交种进行检测，再进行纯种和杂交种的鉴定以及种群数目K值的判断，最后获取杂交情况。如此利用了SSR标记具有共显性的特点，大多数情况下微卫星在生物的基因组中分布，变异位点中包含很多遗传基因，从而在鉴定宁夏枸杞和黑果枸杞杂交种的SSR标记的开发和应用中，达到多态性稳定且重复率高、操作便利、灵敏度好等效果。

技术研发人员：张得芳,唐昊,史文君,刘晓雯
受保护的技术使用者：青海省农林科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15