一种具有焦亡执行蛋白功能的聚合物及其制备方法和应用

本发明涉及医药，具体涉及一种具有焦亡执行蛋白功能的聚合物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞焦亡是一种免疫原性死亡方式，能将冷肿瘤转化成热肿瘤，因此在肿瘤免疫治疗中被寄予厚望，但其发生依赖于焦亡执行蛋白(gasdermin)的参与。gasdermins(gsdms)家族蛋白被活化后，会被切割成活性成分n-gasdermins(n-gsdms)，其能通过静电相互作用与细胞膜内侧的阴离子脂质磷脂(主要是磷脂酰丝氨酸(ps))结合，从而在细胞膜上发生寡聚化，在细胞膜上打孔，导致细胞内外渗透压变化，诱导细胞出泡，并释放出炎症因子，从而导致细胞表现出焦亡的表型(the gasdermins,a protein family executingcell death and inflammation.nat rev immunol 2020,20(3),143.)。因此焦亡执行蛋白的表达是细胞发生焦亡的前提，现有技术中也有研究促使焦亡执行蛋白表达的化合物，如cn 116514738 a公开了一种细胞焦亡前药，能够通过靶向溶酶体，光照下，产生的活性氧能够激活caspase-1切割gsdmd蛋白，在细胞膜上打孔，引发细胞焦亡。

2、但遗憾的是，肿瘤细胞可以通过选择性沉默gsdms相关蛋白的表达来躲避这种死亡方式，从而使肿瘤处于一种免疫抑制的微环境，极大程度的限制了焦亡策略在肿瘤免疫治疗的中的应用(gasdermin e suppresses tumour growth by activating anti-tumourimmunity.nature 2020,579(7799),415.)。

3、活化的焦亡执行蛋白n-gsdms不仅能与细胞膜内侧阴离子脂质ps结合，其还能直接与细菌膜外侧的心磷脂(cardiolipin)结合，直接在细菌膜上打孔，消灭细菌，避免感染的发生。但体内gsdms蛋白的异常结合，也会导致炎症风暴、血栓等多种问题(channellinginflammation:gasdermins in physiology and disease.nat rev drug discov 2021,20(5),384.)。

4、因此，能否设计一种高分子聚合物，其具有和活化n-gsdms类似的与阴离子脂质结合的能力，在不表达gsdms的肿瘤细胞内也能与细胞膜内侧的ps结合，导致肿瘤细胞膜破裂出泡，释放出内容物，使细胞发生类似焦亡的免疫原性死亡，以激活免疫系统。与此同时，该聚合物也同时可与细菌膜上的心磷脂结合，导致细菌膜破裂，从而杀灭细菌。获得兼具抗肿瘤和抗菌疗效的类焦亡蛋白高分子聚合物，这将对肿瘤免疫治疗的研究具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明针对细胞焦亡过程中依赖gsdms家族蛋白的表达的问题，提供一种gsdms的类似物，其能快速被细胞内化并与细胞膜内侧的ps结合，诱导细胞破膜，出泡，并释放出炎症因子，从而在不表达gsdm家族蛋白的细胞中也产生类似焦亡表型，可作为gsdm蛋白的替代者，用于细胞死亡行为的研究。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、一种具有焦亡执行蛋白功能的聚合物，具有如下所示结构：

4、

5、其中，r2＝-co(ch2)nch3；x＝2～15，y＝10～30，z＝0～10，n＝1～18。

6、受gasdermin蛋白破膜原理的启发，本发明设计了具有和细胞膜内侧酸性磷脂(磷脂酰丝氨酸，ps)高效结合能力的聚合物，以商业化的ε-聚赖氨酸(epl)为骨架，通过在其结构中嫁接可与阴离子脂质特异性结合的结构单元，借助高分子的多价共价效应、结构中的dpa-zn基团(r1)，该聚合物可快速被整合进细胞，并与细胞膜内侧ps结合，扰乱细胞膜电位，在细胞膜内侧破膜，诱导细胞出泡，释放出炎症因子，从而在不表达gsdms家族蛋白的细胞中发挥类似焦亡执行蛋白gsdms功能，使细胞通过类似焦亡的方式死亡，因此该聚合物可作为gsdms蛋白的替代者，用于细胞死亡行为的研究。

7、另一方面，由于该聚合物可诱导细胞发生免疫原性死亡，因此其可有效的激活肿瘤免疫能力，展现出优异的抗肿瘤效果，在肿瘤免疫治疗中也有较大应用前景。此外该聚合物也能与细菌膜外侧的阴离子脂质心磷脂结合，从而使细菌膜破裂，在短时间内就能把细菌杀死，有着很好的抗菌治疗效果。

8、当z＝0时，所述聚合物结构如下，命名pdpa-zn：

9、

10、当z不为0时，所述聚合物结构如下，命名为dpdpa-zn：

11、

12、本发明在上述聚合物骨架基础上，引入了脂肪链，即z不为0，增加聚合物与细胞膜的作用能力，能够大幅缩短材料破膜时间。因此更优选z不为0。

13、优选地，x＝2-10，y＝10-30，z＝2-10，n＝8-16。

14、当x<2时，聚合物中接枝dpa的单元数较少，与ps的结合能力较弱，而由于空间位置的限制，x修饰个数最多也就只能修饰至10个左右，因此作为优选x的范围为2-10；

15、z的修饰个数也存在平衡，修饰太少，对细胞膜的作用力较弱，修饰太多聚合物结构变得疏水，会变得在水中无法溶解。因此，作为优选，本专利中z的范围限制在2-10；

16、剩下的游离-nh2数量也即y的个数由x和z的个数决定，作为优选，在本专利中限定范围为y＝10-30

17、进一步优选地，n＝8-12，进一步优选n＝10。

18、本发明还提供所述的具有焦亡执行蛋白功能的聚合物的制备方法，包括步骤：

19、步骤1，使α,α′-二氯对二甲苯(dx)和二甲基吡啶胺(dpa)混合，在催化剂作用下反应得到dx-dpa单体；

20、步骤2，使ε-聚赖氨酸(epl)溶解在溶剂中，加入所述dx-dpa单体，在催化剂作用下聚合反应得到聚合物pdpa；

21、当z＝0时，步骤3，将所述pdpa和锌盐溶于溶剂中，搅拌混合，去除溶剂后加水透析，冻干得到所述具有焦亡执行蛋白功能的聚合物pdpa-zn。

22、反应式如下：

23、

24、当z不为0时，步骤3替换为如下步骤：

25、步骤3-1，将所述pdpa溶于无机碱溶液中，冰浴下滴加clco(ch2)nch3，反应结束后透析、冻干得到含脂肪链的聚合物dpdpa；n＝1-18；

26、步骤3-2，将dpdpa和锌盐溶于溶剂中，搅拌混合，去除溶剂后加水透析，冻干得到所述具有焦亡执行蛋白功能的聚合物dpdpa-zn。

27、反应式如下：

28、

29、步骤1中α,α′-二氯对二甲苯和二甲基吡啶胺的摩尔比为2-2.5:1；为保证α,α′-二氯对二甲苯中的只有一个卞氯发生反应，反应过程中保证α,α′-二氯对二甲苯与二甲基吡啶胺的摩尔当量大于2。

30、步骤1中所述催化剂包括碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾中任一种或多种；

31、步骤1采用的溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、n,n-二甲基吡啶胺、二甲基亚砜中任一种或多种；

32、步骤1的反应时间为24-72h，反应温度为室温；

33、步骤2中催化剂包括碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾中任一种或多种；

34、步骤2、步骤3和步骤3-1中溶剂独立包括甲醇、乙醇、水中一种或多种；

35、步骤2反应条件为40-60℃下反应24-72h；

36、步骤2中ε-聚赖氨酸中氨基和dx-dpa单体摩尔比为1:1-1:10；

37、步骤3中锌盐用量为pdpa上所接枝dpa单体的1-5当量；步骤3的反应条件为室温下反应2-4h；

38、步骤3-1中，pdpa中的游离氨基与clco(ch2)nch3的摩尔比为1:1-1:10，滴加结束后反应条件为室温下反应2-4h；

39、步骤3-1中，所述无机碱包括氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾中一种或多种；

40、步骤3-2中，锌盐用量为dpapa上所接枝dpa单体的1-5当量；步骤3-2的反应条件为室温下反应2-4h；

41、所述锌盐包括硝酸锌、硫酸锌、氯化锌中一种或多种。

42、透析过程中采用透析袋截留分子量范围为1k-5k，去除多余zn2+。

43、本发明还提供所述的具有焦亡执行蛋白功能的聚合物在制备细胞焦亡诱导试剂盒中的应用，其中细胞焦亡的产生不依赖于焦亡执行蛋白。

44、本发明还提供一种细胞焦亡诱导试剂盒，包括所述具有焦亡执行蛋白功能的聚合物。

45、本发明还提供所述的具有焦亡执行蛋白功能的聚合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

46、本发明还提供所述的具有焦亡执行蛋白功能的聚合物在制备抗菌药物中的应用。

47、本发明还提供一种抗菌或治疗肿瘤的药物，其活性成分包括所述具有焦亡执行蛋白功能的聚合物。

48、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

49、(1)本发明涉及合成了一种可与细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸结合的聚合物，该聚合物可快速被整合进细胞，扰乱细胞膜电位，从而在细胞膜内侧破膜，诱导细胞出泡，释放出炎症因子，从而发挥类似焦亡执行蛋白gsdms的功能，使细胞通过类似焦亡的方式死亡，展现出优异的抗肿瘤效果。

50、(2)本发明合成的聚合物具有高效的细胞破膜、诱导细胞出泡和释放炎症因子能力，从而使细胞表现出类似细胞焦亡表型，而且这种现象是不依赖于细胞内焦亡执行蛋白gsdms的参与，可克服肿瘤细胞或者细菌自身不表达焦亡执行蛋白而不能发生焦亡的固有缺陷，可用于焦亡死亡途径的机理研究，如制备成细胞焦亡检测的试剂盒等。

51、(3)本发明合成的聚合物能与细菌膜外侧的阴离子脂质心磷脂结合，从而使细菌膜破裂，在短时间内就能把细菌杀死，具有优异的抗菌治疗效果。

52、(4)焦亡执行蛋白需要复杂的细胞内剪切活化过程，因此就算是在焦亡执行蛋白表达的细胞系，焦亡的发生也需要数小时，且焦亡发生率较低。本发明中设计合成的聚合物可快速进入肿瘤细胞，且不依赖于上游信号通路的激活，因此可在数分钟内就诱导细胞或者细菌膜破裂，达到杀灭肿瘤细胞或者细菌的效果。

53、因此本专利中设计合成的细胞破膜聚合物，既具有很强的科学研究价值，如对细胞破膜出泡行为进行研究等，同时又具有很好的临床转化前景，具有较大的应用价值。