靶向c-MET的嵌合抗原受体、CAR-M及其用途

本公开涉及临床、生物学、肿瘤学领域。

背景技术：

1、胰腺癌发病率呈明显升高趋势，其预后极差，总体5年生存率仅约为10％。到2030年，胰腺癌有可能成为第二大癌症死亡原因。以嵌合抗原受体-t细胞(car-t)为代表的过继免疫细胞治疗以及以pd-l1以及ctla4为代表的免疫检查点抑制治疗是肿瘤免疫治疗取得成功的里程碑事件，但是这两种治疗方法在胰腺癌中效果极其有限。car-t在实体肿瘤中的应用面临诸多困难，仍未能有效解决。

2、巨噬细胞(car-m)较car-t具有更强的肿瘤组织内浸润能力、吞噬及杀伤能力、抗原呈递能力以及微环境重塑能力，是细胞免疫治疗最前沿领域。巨噬细胞具有强大的向肿瘤组织中迁移的能力，从而解决了效应细胞不能进入肿瘤组织中的难题。car-m会同时具有特异性和非特异的广泛吞噬及杀伤能力。car-m细胞可以作为高效的抗原呈递细胞，继而激活效应t细胞。最后，作为肿瘤微环境调控的关键细胞，car-m可以改善肿瘤微环境的免疫抑制状态。

3、目前，仅有少量的car-m临床前研究报道。迄今，clinicltrial.org仅有一项注册临床研究。klichinsky等开发了人car-pbcm-her2并发现其可以明显延长her2阳性的荷小鼠的生存期以及减少转移的肿瘤负荷。迄今，国内外未见car-m在胰腺癌中的研究报道。

技术实现思路

1、c-met被称为细胞间质上皮转换因子，其为受体酪氨酸激酶家族成员，在多种肿瘤中被异常激活，促进肿瘤生长。发明人发现，c-met在胰腺癌中广泛高表达，促进胰腺癌进展，与患者预后呈负相关，可以成为car-m治疗的潜在靶点。

2、鉴于此，根据本技术的一些实施方案，提供了一种靶向c-met的构建体，并在体外验证了靶向c-met的car-m细胞(以下简称car-m-c-met细胞)对高表达c-met的实体肿瘤(如胰腺癌)的特异性结合及杀伤能力。

3、根据本技术的一些实施方案，提供了一种靶向人c-met的构建体。

4、靶标是指本公开的构建体所针对的客体；靶标可以是核酸(基因、mrna等)，也可以是蛋白(前体、成熟蛋白、同种型、变体等)。在本公开中，靶标尤其是指人c-met基因或其表达产物。

5、本公开中人c-met应作做广泛的解读，是指人c-met基因本身及其在各阶段中各种形式的表达产物，例如但不限于基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cdna、mrna、前体蛋白、成熟蛋白、天然变体、修饰形式、及其片段。

6、作为一个具体的示例，本公开中的靶标是人c-met蛋白或肿瘤细胞表面表达的c-met。

7、人c-met的核苷酸或氨基酸信息是本领域公知的，例如但不限于可以从文献或数据库中获取。技术人员应当理解，人c-met不限于特定数据库中的登录号，还意图涵盖现有技术中任何文献、书籍、数据库中的等同指代物。

8、根据本技术的一些实施方案，靶向人c-met的构建体是式1所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：

9、信号肽-scfv-铰链区-跨膜结构域-细胞内激活信号结构域(式1)。

10、可以根据n-和c-末端结构域的位置，对跨膜蛋白进行分类。i、ii、iii型为一次跨膜蛋白，iv型是多次跨膜蛋白。i型跨膜蛋白用停止-传输锚定序列锚定到脂质膜上，其n-末端结构域在合成时瞄准于内质网腔，如果成熟形式是位于质膜上，则n-末端结构域则瞄准于细胞外间隙。

11、鉴于上述，原则上任何i型跨膜蛋白的信号肽均适用于本技术的信号肽。作为一个非限制性示例，信号肽是cd8信号肽或igk信号肽。一些具体的实施方案中，所述cd8信号肽是seq id no：11所示。

12、一些实施方案中，所述scfv(single chain antibody fragment)特异性结合人c-met。scfv是由抗体重链可变区vh和轻链可变区vl通过15-20个氨基酸的接头(linker)连接而成的单链抗体。在结构上，可以将vh的n端与vl的c端相连，也可以将vl的n端与vh的c端相连。尽管接头的序列差异很大，但car领域中常用的接头包含重复的甘氨酸和丝氨酸残基，以提供抗原结合位点改变构象所需的灵活性，并在水溶液中保持良好的稳定性。

13、接头长度会影响scfv的各种结构特征，例如大小、灵活性和化合价。大于12个残基的接头有助于可变结构域以自然方向折叠并形成单价抗原结合位点。相反，较短的接头限制可变结构域的灵活性，阻止了分子内可变链配对，有利于分子间的寡聚化和scfv多聚体的形成。在一些实施方案中，示例性的接头是seq id no：23所示。

14、在一些实施方案中，靶向人c-met的构建体是式1-1所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：

15、信号肽-vh-接头-vl-铰链区-跨膜结构域-细胞内激活信号结构域

16、(式1-1)。

17、在另一些实施方案中，靶向人c-met的构建体是式1-2所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：

18、信号肽-vl-接头-vh-铰链区-跨膜结构域-细胞内激活信号结构域

19、(式1-2)。

20、一些具体的实施方案中，所述重链可变区包含：seq id no：3所示的hcdr1、seq idno：4所示的hcdr2、seq id no：5所示的hcdr3；所述轻链可变区包含：seq id no：6所示的lcdr1、seq id no：7所示的lcdr2和seq id no：8所示的lcdr3。

21、一些具体的实施方案中，所述scfv包含seq id no：1所示的重链可变区和seq idno：2所示的轻链可变区。

22、一些具体的实施方案中，所述scfv是seq id no：9所示。

23、一些实施方案中，所述铰链区选自以下的任一项：cd8的铰链区、cd28的铰链区、igg1的铰链区、igg4的铰链区。

24、一些具体的实施方案中，所述铰链区是cd8的铰链区。

25、一些具体的实施方案中，所述铰链区是seq id no：21所示。

26、跨膜结构域的功能是将本公开的构建体锚定在巨噬细胞细胞膜上，理论上cd8(如cd8a)、cd3ζ、cd4、cd28的跨膜结构域均适用。一些具体的实施方案中，所述cd8跨膜结构域是seq id no：13所示。

27、一些实施方案中，所述细胞内激活信号结构域包含：fcer1g的免疫受体酪氨酸激活结构域和cd19的tyr-x-x-met结构域(简称yxxm，如yedm、yenm)。

28、选择fcer1g的免疫受体酪氨酸激活结构域(如fcer1g第45-86aa)的理由在于；本技术出乎意料地发现引入该区域的car可触发syk、card9和nf-kb的激活，从而介导巨噬细胞的活化。

29、b细胞表面表达的cd19，其包含一段tyr-x-x-met结构域，能够结合pi3k激酶(phosphatidylinositol 3-kinase)。本技术出乎意料地发现引入该区域的car促使car-m细胞中pi3k激酶的募集。

30、一些具体的实施方案中，所述fcer1g的免疫受体酪氨酸激活结构域是seq id no：15所示。

31、一些具体的实施方案中，所述tyr-x-x-met结构域是seq idno：17所示。

32、所述fcer1g的免疫受体酪氨酸激活结构域和所述cd19的tyr-x-x-met结构域能够互换顺序。

33、在一些实施方案中，靶向人c-met的构建体是式1-3所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：

34、信号肽-vh-接头-vl-铰链区-跨膜结构域-fcer1g的免疫受体酪氨酸激活结构域-yxxm结构域

35、(式1-3)。

36、在另一些实施方案中，靶向人c-met的构建体是式1-4所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：

37、信号肽-vl-接头-vh-铰链区-跨膜结构域-fcer1g的免疫受体酪氨酸激活结构域-yxxm结构域(式1-4)。

38、在另一些实施方案中，靶向人c-met的构建体是式1-5所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：

39、信号肽-vh-接头-vl-铰链区-跨膜结构域-yxxm结构域-fcer1g的免疫受体酪氨酸激活结构域

40、(式1-5)。

41、在另一些实施方案中，靶向人c-met的构建体是式1-6所示，按照从氨基端至羧基端的顺序：

42、信号肽-vl-接头-vh-铰链区-跨膜结构域-yxxm结构域-fcer1g的免疫受体酪氨酸激活结构域(式1-6)。

43、在具体的实施方案中，靶向人c-met的构建体是seq id no：19所示。

44、根据本技术的一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码前述任一靶向人c-met的构建体。

45、在具体的实施方案中，所述多核苷酸是seq id no：20所示。

46、除非另有说明，否则特定的多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列。

47、根据本技术的一些实施方案，提供了一种表达载体。

48、术语“载体”意指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是质粒，其是指环状双链dna环，其中可以连接附加的dna区段。另一种类型的载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体(aav或aav2)，其中另外的dna区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。

49、术语“表达载体”是指可对宿主细胞进行转化，且含有指导和/或控制(连同宿主细胞一起)与其可操作地连接的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列的载体。

50、原则上所有过表达质粒都可以用于表达本公开的构建体。作为一个示例，例如但不限于gv401、pet、pgex、pmal、pt7、crispr/cas9系统。

51、在一些实施方案中，表达载体包含前述多核苷酸。

52、在具体的实施方案中，表达载体是病毒载体。作为一个示例，病毒载体选自以下的任一项：慢病毒载体、逆转录病毒、腺病毒载体。

53、根据本技术的一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其表达前述靶向人c-met的构建体。

54、在具体的实施方案中，宿主细胞是巨噬细胞。作为一个示例，所述巨噬细胞获自待治疗的受试者、或同种异体的受试者。

55、术语“受试者”或“个体”包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)例如非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则所述术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。在具体的实施方案中，个体或受试者是人。

56、根据本技术的一些实施方案，提供了前述靶向人c-met的构建体在制备car-m中的用途。

57、根据本技术的一些实施方案，提供了前述多核苷酸在制备car-m中的用途。

58、根据本技术的一些实施方案，提供了前述表达载体在制备car-m中的用途。

59、根据本技术的一些实施方案，提供了前述宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗高表达c-met的实体肿瘤(如胰腺癌)。