一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

本发明涉及微生物基因工程，尤其涉及一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、农作物秸秆，是大自然中最宝贵、最便宜的可再生资源之一，是潜在的动物饲料来源，同时也是规模最大的一类农业废弃物，全世界每年可产生超过五十亿吨的农作物残茬。农作物秸秆的主要成分木质素、纤维素、半纤维素等，均属于芳香族高分子化合物，具有难以在自然环境中被降解的复杂三维结构，阻碍纤维素和半纤维素被进一步利用，因而常对秸秆进行预处理以提高纤维素的利用率。预处理方法可分为物理法、化学法和生物法。相对于前两种方法，生物降解更能节省人力、物力和财力，是一种较为理想的降解纤维素的方法。纤维素酶可分为三类：内切葡聚糖酶(endoglucanase,eg,ec:3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase,cbh,ec:3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,bg,ec:3.2.1.21)，它们协同作用于纤维素使其彻底降解为葡萄糖。

2、枯草芽孢杆菌作为一种被深入研究的模式菌，其代谢机理和遗传背景相对清晰，具有异源蛋白分泌能力强、低品质碳源上生长特性好、无明显密码子偏好性等特点，属于我国的饲用益生菌准用菌种，现已应用于构建酶、维生素、功能性糖等天然产物合成的微生物细胞工厂。虽然枯草芽孢杆菌本身具备良好的纤维素酶分泌能力，但因其纤维素酶系不完整，单菌直接作用于粗饲料的降解效果不佳，尤其体现在外切葡聚糖酶和木质素酶的缺乏方面，不能高效破坏植物细胞壁的纤维结晶结构。因此，通过对枯草芽孢杆菌的遗传改造或异源酶基因的高效表达，获得具有益生菌特性且能高效降解纤维素的枯草芽孢杆菌基因工程重组菌能够更加满足畜禽养殖业中饲用微生物添加的生产需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌c6-aea3，所述枯草芽孢杆菌c6-aea3分类为bacillussubtilis，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2023年8月31日，保藏编号为cctccno:m 20231579。

4、本发明还提供了所述的枯草芽孢杆菌c6-aea3的构建方法，包括如下步骤：

5、以野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株，依次在所述出发菌株中敲入内切葡聚糖酶基因、外切葡聚糖酶基因和β-葡聚糖酶基因；

6、所述野生型枯草芽孢杆菌为bacillus subtilis c6，野生型枯草芽孢杆菌bacillus subtilis c6，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2022年9月26日，保藏编号为cctccno:m 20221488。

7、作为优选，所述敲入的方法基于crispr/cas9系统。

8、作为优选，所述内切葡聚糖酶基因为内切葡聚糖酶基因gene2006；所述内切葡聚糖酶基因gene2006的核苷酸序列如seq id no.1所示；

9、敲入所述内切葡聚糖酶基因的位点为野生型枯草芽孢杆菌的apre位点。

10、作为优选，所述外切葡聚糖酶基因为外切葡聚糖酶基因cel48s；所述外切葡聚糖酶基因cel48s的核苷酸序列如seq id no.2所示；

11、敲入所述外切葡聚糖酶基因的位点为野生型枯草芽孢杆菌的epr位点。

12、作为优选，所述β-葡聚糖酶基因为β-葡聚糖酶基因gene4296；所述β-葡聚糖酶基因gene4296的核苷酸序列如seq id no.3所示；

13、敲入所述β-葡聚糖酶基因的位点为野生型枯草芽孢杆菌的amye位点。

14、本发明还提供了所述的枯草芽孢杆菌c6-aea3或者所述的构建方法构建得到的枯草芽孢杆菌c6-aea3在制备降解纤维素的产品中的应用。

15、本发明还提供了所述的枯草芽孢杆菌c6-aea3或者所述的构建方法构建得到的枯草芽孢杆菌c6-aea3在制备降解秸秆中纤维素的产品中的应用；

16、所述秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆和水稻秸秆中的一种或几种。

17、本发明还提供了一种降解秸秆中纤维素的方法，包括如下步骤：

18、将秸秆、浸润培养基与发酵菌液混合，发酵6～8d；

19、所述发酵菌液为所述的枯草芽孢杆菌c6-aea3或者所述的构建方法构建得到的枯草芽孢杆菌c6-aea3制备得到的发酵菌液；

20、所述发酵菌液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌c6-aea3接种于lb培养基中，培养15～17h，得到活化的菌液；将所述活化的菌液接种于lb培养基中，培养20～28h，得到发酵菌液。

21、作为优选，所述秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆和水稻秸秆中的一种或几种；

22、所述秸秆的粒径≤1mm；

23、所述浸润培养基以水为溶剂，还包括如下浓度的组分：

24、硝酸铵4～6g/l、七水硫酸镁4～6g/l、氯化钠0.8～1.2g/l；

25、所述秸秆与浸润培养基的质量体积比为3～5g：15～25ml；

26、所述秸秆与发酵菌液的质量体积比为3～5g：1ml；

27、所述发酵的温度为36～38℃。

28、本发明提供的一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，本发明的方案具有如下优点：

29、本发明获得的共表达多元纤维素酶基因枯草芽孢杆菌c6-aea3具有高纤维素酶活，能高效降解秸秆饲料中的纤维素，为农作物秸秆生物降解提供有效的菌种资源。

30、本发明构建得到的枯草芽孢杆菌c6-aea3的内切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活等纤维素酶活相关指标较出发菌株显著升高。

31、本发明构建的纤维素酶基因枯草芽孢杆菌c6-aea3能有效破坏多种秸秆饲料的纤维素表面形态结构，玉米秸秆、小麦秸秆和水稻秸秆的中性洗涤纤维(ndf)含量分别降低5.6％、2.8％、5.7％，酸性洗涤纤维(adf)含量分别降低21.7％、17.3％、19.4％，半纤维素含量分别降低1.1％、4.3％、3.2％，木质素含量分别降低2.7％、8.7％、5.9％，纤维素结晶度分别降低3.1％，8.8％、12.3％。本发明构建的菌株c6-aea3能够显著降解秸秆类纤维素生物质，为提高畜牧行业饲料的利用效率奠定基础。

技术特征：

1.一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌c6-aea3，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌c6-aea3分类为bacillussubtilis，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2023年8月31日，保藏编号为cctcc no:m 20231579。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌c6-aea3的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述敲入的方法基于crispr/cas9系统。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述内切葡聚糖酶基因为内切葡聚糖酶基因gene2006；所述内切葡聚糖酶基因gene2006的核苷酸序列如seq id no.1所示；

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述外切葡聚糖酶基因为外切葡聚糖酶基因cel48s；所述外切葡聚糖酶基因cel48s的核苷酸序列如seq id no.2所示；

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述β-葡聚糖酶基因为β-葡聚糖酶基因gene4296；所述β-葡聚糖酶基因gene4296的核苷酸序列如seq id no.3所示；

7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌c6-aea3或者权利要求2～6任意一项所述的构建方法构建得到的枯草芽孢杆菌c6-aea3在制备降解纤维素的产品中的应用。

8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌c6-aea3或者权利要求2～6任意一项所述的构建方法构建得到的枯草芽孢杆菌c6-aea3在制备降解秸秆中纤维素产品中的应用；

9.一种降解秸秆中纤维素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆和水稻秸秆中的一种或几种；

技术总结
本发明涉及微生物基因工程技术领域，尤其涉及一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。本发明涉及的枯草芽孢杆菌C6‑AEA3分类为Bacillus subtilis，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2023年8月31日，保藏编号为CCTCC NO:M 20231579。本发明得到的枯草芽孢杆菌C6‑AEA3具有高纤维素酶活性，能高效降解秸秆饲料中的纤维素，为农作物秸秆生物降解提供有效的菌种资源。

技术研发人员：杨雨鑫,陈玉林,刘功炜,公涵萱,崔雯元
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15