获得杀虫活性提高的Vip3Aa突变体的方法及其突变体蛋白

本发明属于分子生物，具体涉及一种通过点突变技术获得杀虫活性升高的vip3aa突变体蛋白的方法及由此得到杀虫活性升高的vip3aa突变体蛋白。

背景技术：

1、苏云金杆菌(bacillus thuringiensis，bt)是一种重要的昆虫病原菌，来自bt的杀虫蛋白是合成农药最成功的替代品，在农作物中表达bt的蛋白可实现对不同害虫的特异性防治。目前bt作物在全球种植面积已经超过2.022亿公顷。cry类杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins,icp)是bt产生的最大一类的杀虫蛋白，也是bt作物中表达的最主要的蛋白，在20世纪90年代已经开始商业化应用。但是，bt作物的可持续利用受到害虫抗性发育的威胁，已经报道了多种bt的cry蛋白抗性昆虫。在农作物中表达至少两种在昆虫肠道中具有不同结合位点的bt蛋白，可实现对目标害虫较持久的防治。因此，寻找与cry蛋白毒素作用机理不同的杀虫毒素延缓害虫抗性发展迫在眉睫。

2、营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins，vip)是在苏云金杆菌的营养生长阶段产生的对多种鳞翅目害虫具有杀虫活性的蛋白。vip蛋白被分为vip、vpb1、vpb4和vpa四类，其中vip家族中的vip3a类蛋白应用最为广泛，由于其与cry蛋白没有序列同源性且具有不同的结合位点，已经被应用于bt作物中以延缓害虫抗性的发展。

3、vip3a类蛋白以约89kda的原蛋白被分泌，经幼虫摄入后，被中肠蛋白酶水解激活。vip3a蛋白被水解激活后才具有杀虫活性，且被水解激活前后该蛋白都是以四聚体形式存在。膜穿孔机制是被普遍认可的vip3a类蛋白的杀虫机制，需要特异性受体参与，即vip3a蛋白与靶标昆虫中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles，bbmvs)上多种特定受体发生结合，最终插入细胞膜形成孔洞，通过形成稳定的离子通道来完成其杀虫作用。vip3aa蛋白包括五个结构域，结构域ⅰ、结构域ⅱ、结构域ⅲ、结构域ⅳ以及结构域ⅴ，其中结构域ⅰ至结构域ⅲ是蛋白四聚化所必需的，结构域ⅲ包含三个折叠片层，与杀虫晶体蛋白中的cry类蛋白结构域ⅱ相似，在cry蛋白结构域ⅱ中，连接反向折叠的loops参与受体的识别、结合以及毒素的特异性。因此，基于结构相似功能相似的想法，发明人推测vip3aa蛋白的结构域ⅲ的折叠片层中连接反向折叠的loops(loop4-5、loop9-10、loop14-15)也可能具有相似的功能；氨基酸序列保守性最差的loop12-13也可能跟受体识别有关，进而影响其膜穿孔功能和毒力。

技术实现思路

1、针对上述领域中存在的问题，本发明提供了一种通过点突变技术获得杀虫活性提高的vip3aa突变体的方法及其突变体，利用该方法获得了杀虫活性提高的vip3aa突变体。

2、本发明采用该方法，对vip3aa蛋白进行突变，获得11个突变体，该11个突变体对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性有明显的提高。

3、本发明发现了通过利用反向pcr技术对vip3aa的结构域ⅲ中的loop区域进行全丙氨酸突变，能够找到显著影响该蛋白对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性的loop区域，对该loop区域的氨基酸进行点突变能够提高vip3aa与草地贪夜蛾中肠bbmvs受体的结合能力，从而增加该蛋白对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性。

4、基于此，一方面，本发明提供了一种通过点突变技术获得杀虫活性提高的vip3aa突变体的方法。

5、所述方法利用点突变技术在基于单点突变的基础上进行了组合突变。

6、另一方面，本发明提供了杀虫活性提高的vip3aa突变体，所述突变体与野生型vip3aa蛋白相比，将野生型vip3aa蛋白的结构域ⅲ中的loop区域对应的氨基酸进行了定点突变。

7、所述定点突变位点包括结构域ⅲ中的loop4-5或/和loop9-10或/和loop12-13或/和loop14-15对应的氨基酸。

8、在一个实施方式中，所述vip3aa蛋白的结构域ⅲ为对应于seq id no.1所示序列的第325位到第536位氨基酸。

9、在一个实施方式中，所述野生型vip3aa蛋白结构域ⅲ中的loop4-5对应于seq idno.1所示序列的第365位到第367位氨基酸，loop9-10对应于seq id no.1所示序列的第429位到第434位氨基酸，loop12-13对应于seq id no.1所示序列的第468位到第473位氨基酸，loop14-15对应于seq id no.1所示序列的第498位到第501位氨基酸。

10、在一个实施方式中，所述定点突变位点包括，将结构域ⅲ中loop区域对应的氨基酸残基利用定点突变技术进行丙氨酸或其它氨基酸突变。

11、在一个实施方式中，所述突变包括以下a-b任一所述的方式：

12、a.将对应于结构域ⅲ中的loop4-5或/和loop9-10或/和loop12-13或/和loop14-15的氨基酸进行任一突变；

13、b.将a中所述的单点突变进行任意组合突变。

14、在一个具体的实施方式中，将对应于seq id no.1所示的第366位s突变为t或l，或/将第470位n突变为k，或/将第501位r突变为a。

15、在一个具体的实施方式中，将对应于seq id no.1所示的第366位s突变为t或l，或/将第470位n突变为k，或/将第501位r突变为a进行任意组合突变。

16、所述鳞翅目害虫为草地贪夜蛾。

17、本发明中，氨基酸残基用单字母表示，如丙氨酸a，谷氨酸e，谷氨酰胺酸q，甘氨酸g，组氨酸h，异亮氨酸i，脯氨酰胺酸p，苯丙氨酸f，半胱氨酸c，缬氨酸v，酪氨酸y，天冬酰胺酸n，蛋氨酸m，天门冬氨酸d，赖氨酸k，丙氨酸a，精氨酸r，亮氨酸l，苏氨酸t，丝氨酸s。

18、本发明中，在vip3aa蛋白中结构域ⅲ中的loop区域对应的氨基酸中进行定点突变，能够增强鳞翅目害虫中肠bbmvs与vip3aa蛋白结合能力，从而提高vip3aa蛋白对鳞翅目害虫的杀虫活性。

19、另一方面，本发明还提供了编码上述vip3aa突变体的基因；包含所述基因的载体；包含所述基因或所述载体的宿主细胞。

20、另一方面，本发明还提供了一种增强鳞翅目害虫中肠bbmvs与vip3aa蛋白结合能力的方法，所述方法包括对vip3aa蛋白进行突变得到vip3aa突变体的步骤；所述方法还包括将vip3aa突变蛋白与鳞翅目害虫中肠bbmvs竞争结合的步骤。

21、所述鳞翅目害虫中肠bbmvs来源于草地贪夜蛾的中肠，在一个具体的实施方式中，利用氯化镁密度梯度离心法(文献preparation and partial characterization ofamino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgutof the gypsy moth(lymantria dispar))提取草地贪夜蛾bbmvs即为本发明中所使用的bbmvs。