一种获得高纯度神经细胞的方法

本发明涉及生物领域，具体涉及一种获得高纯度神经细胞的方法。

背景技术：

1、目前已有研究证明，将多巴胺能神经元移植到患有帕金森或亨廷顿病人的大脑中，神经元不仅能存活还能缓解疾病症状，给疾病的治疗带来希望。但是移植所需的神经细胞从何而来却是一大难题。体内极难分离得到大量纯化的神经谱系细胞，所以体外分化产生人神经谱系的细胞进行细胞治疗是最切实可行的方法。

2、为了在体外获得神经谱系的细胞，前期的研究中科学家将神经相关的转录因子在体细胞内过表达，成功将体细胞转变为神经谱系的细胞。但是这种转分化的方式效率低下，并且无法获得大量的可用于移植的神经谱系的细胞，所以其应用前景有限。

3、人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hescs)拥有无限增殖的潜能，并且能分化为所有类型的体细胞，所以其在再生医学领域有很好的应用前景。目前有两种常用的方法将hescs诱导为神经谱系的细胞。第一种是利用hescs具有多向分化的潜能，诱导其形成eb球从中分离得到神经干细胞；第二种是根据发育生物学知识利用化学成分清晰的培养基诱导其分化为神经干细胞。经典的分化方法是利用n2、b27培养基并添加小分子sb431542和dorsomorphin抑制tgfβ-smad信号通路，提高hescs分化为神经干细胞的效率。但是这两种方法都有一个明显的缺陷，无法高效的指导hescs特定的向神经谱系分化，在诱导过程中会有其它谱系的细胞出现。

4、除此之外，神经干细胞在体外培养会自发分化为神经元和胶质细胞，即使在fgf2和egf等因子的作用下能促进神经干细胞的增殖，但是仍然无法阻止其自发分化，这一现象导致在体外大量扩增神经干细胞存在困难。鉴于此，本发明一种获得高纯度神经细胞的方法。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题如何解决在体外大量扩增神经干细胞时存在的纯度不够的现象。目的是提供一种获得高纯度神经细胞的方法，以获得高纯度神经细胞。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供一种获得高纯度神经细胞的方法，包括如下步骤：

4、(1)敲除人多能干细胞的hbo1基因，获得敲除hbo1基因的人多能干细胞株；

5、(2)将所述敲除hbo1基因的人多能干细胞株向神经外胚层分化，制备得到神经细胞。

6、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

7、进一步，敲除人多能干细胞的hbo1基因为在第九号外显子中删除34144到34325位182bp的核苷酸，序列如seq id no：1所示，在所述删除的位置插入终止密码子，所述终止密码子序列如seq id no：2所示。

8、进一步，所述人多能干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导性多能干细胞进一步，所述人胚胎干细胞为人胚胎干细胞h1系等。

9、另外，根据现有的实验结果和相关文献报道可知在primed胚胎干细胞中应该是同样的表型。

10、进一步，步骤(1)具体为：利用crispr/cas9技术敲除人多能干细胞的hbo1基因，获得敲除hbo1基因的人多能干细胞株。

11、进一步，利用crispr/cas9技术敲除人多能干细胞的hbo1基因包括具体如下的步骤：

12、(1-1)设计靶向hbo1基因的sgrna，克隆至crispr/cas9质粒中，构建靶向hbo1基因敲除的质粒，并构建含有同源臂的donor质粒；

13、(1-2)将步骤(1-1)中靶向hbo1基因敲除质粒和含有同源臂的donor质粒转染到所述人多能干细胞中，经筛选，得到敲除hbo1基因的人多能干细胞株。

14、其中，构建含有同源臂的donor质粒，利用细胞dna同源重组修复精确的敲除hbo1的核心结构域；同源臂有两段，左同源臂称为左臂，右同源臂称为右臂。在基因组中，左臂和右臂中间的序列则是本发明计划敲除的区域；除此之外，本发明还会在左臂的反向上添加终止密码子，确保基因敲除的可靠性；左臂上游引物序列agaggcagggtttgctggctac；左臂下游引物序列ctcctattgccaagaaatcaaaagtca；右臂上游引物序列gcacatggtgagttgtcttgggtt；右臂下游引物序列ctggagaacctgagtcaaagcaaca。

15、进一步，步骤(1-1)中sgrna的核苷酸序列如seq id no:3所示。

16、进一步，步骤(1-1)中，靶向hbo1基因敲除的质粒为含有cas9的px330质粒，含有同源臂donor质粒为含有donor的puc57质粒。

17、进一步，步骤(2)中所述敲除hbo1基因的人多能干细胞株地向神经外胚层分化具体步骤为：将所述敲除hbo1基因的人多能干细胞株在培养基(例如mtesr1培养基)中培养，传代分化得到所述神经细胞。

18、第二方面，提供一种神经细胞的应用，将所述方法获得的神经细胞用于治疗帕金森或亨廷顿的药物中。

19、本发明在研究过程中发现乙酰转移酶hbo1在hescs自我更新以及早期命运决定过程中发挥重要作用，缺失hbo1的人多能干细胞退出多能性，丧失了向中、内胚层分化的潜能，具有向神经外胚层分化的倾向性。因此，构建了可诱导敲除hbo1的人多能干细胞作为种子细胞用于获得高纯度的人神经谱系细胞。并通过以下实验进行构建和验证：

20、(1)通过crispr/cas9技术联合同源重组的方式在人胚胎干细胞系h1中敲除hbo1，发现h1-hbo1-/-hescs退出多能性并特异地向神经外胚层分化，最终形成神经元样细胞；

21、(2)通过构建可诱导敲除hbo1的h1 hescs(h1-oe-hbo1-/-hescs)，在添加强力霉素(doxycycline，dox)的条件下其诱导hbo1的表达维持自我更新，在不添加dox的条件下其缺失hbo1，也会退出多能性并特异的向神经外胚层分化，最终形成神经元样细胞；

22、(3)通过畸胎瘤实验和bmp4诱导原肠胚形成模型，发现缺失hbo1的h1 hescs丧失了向中、内胚层分化的潜能，更倾向于向神经外胚层分化。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果是：敲除人多能干细胞的hbo1基因的细胞退出多能性，无需诱导即可自发分化为神经元样细胞。例如h1-oe-hbo1-/-hescs在添加dox时能维持自我更新大量增殖，撤掉dox后无需诱导自发向神经谱系分化，15天后即可产生神经元样细胞。h1-oe-hbo1-/-hescs丧失了向中、内胚层分化的潜能，更倾向于向神经外胚层分化。

技术特征：

1.一种获得高纯度神经细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述一种获得高纯度神经细胞的方法，其特征在于，敲除人多能干细胞的hbo1基因为在第九号外显子中删除34144到34325位182bp的核苷酸，序列如seq idno：1所示，在所述删除的位置插入终止密码子，所述终止密码子序列如seq id no：2所示。

3.根据权利要求1所述一种获得高纯度神经细胞的方法，其特征在于，所述人多能干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导性多能干细胞。

4.根据权利要求3所述一种获得高纯度神经细胞的方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞包括人胚胎干细胞h1系。

5.根据权利要求1至4任一项所述一种获得高纯度神经细胞的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：利用crispr/cas9技术敲除人多能干细胞的hbo1基因，获得敲除hbo1基因的人多能干细胞株。

6.根据权利要求5所述一种获得高纯度神经细胞的方法，其特征在于：

7.根据权利要求6所述一种获得高纯度神经细胞的方法，其特征在于，步骤(1-1)中sgrna的核苷酸序列如seq id no:3所示。

8.根据权利要求6所述一种获得高纯度神经细胞的方法，其特征在于，步骤(1-1)中，靶向hbo1基因敲除的质粒为含有cas9的px330质粒，含有同源臂donor质粒为含有donor的puc57质粒。

9.根据权利要求1所述一种获得高纯度神经细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中所述敲除hbo1基因的人多能干细胞株地向神经外胚层分化具体步骤为：将所述敲除hbo1基因的人多能干细胞株在培养基中培养，传代分化得到所述神经细胞。

10.一种神经细胞的应用，其特征在于，将权利要求1至9所述的方法获得的神经细胞用于治疗帕金森或亨廷顿的药物中。

技术总结
本发明涉及一种获得高纯度神经细胞的方法，涉及生物领域，敲除人多能干细胞的HBO1基因，获得敲除HBO1基因的人多能干细胞株；将所述敲除HBO1基因的人多能干细胞株向神经外胚层分化，制备得到神经细胞。敲除人多能干细胞的HBO1基因的细胞退出多能性，无需诱导即可自发分化为神经元样细胞，实现获得高纯度的神经细胞。

技术研发人员：请求不公布姓名,请求不公布姓名,请求不公布姓名,请求不公布姓名
受保护的技术使用者：中国科学院香港创新研究院再生医学与健康创新中心有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15