鉴别滑液支原体疫苗株MS-H与野生株的试剂盒及检测方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种鉴别滑液支原体疫苗株ms-h与野生株的试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、滑液支原体(mycoplasma synoviae，ms)主要感染鸡和火鸡，可引致亚临床呼吸道疾病、传染性滑膜炎、蛋壳尖端异常、气囊炎等，给养禽业带来了巨大的经济损失。近年来，ms感染在世界各地等均有报道，其危害已超鸡毒支原体，被世界动物卫生组织(woah)列为应通报疫病。目前ms商品化活疫苗为温度敏感型(ts+)ms-h株和nad非依赖型ms1株，其中弱毒活疫苗ms-h株已用于6大洲26个国家商品化家禽群，中国于2017年批准使用。接种ms-h株有助于预防或减轻临床症状，减少经济损失，但不可完全避免野生株感染，亟需建立在免疫鸡群中可同时检测ms-h株和野生株的方法。

2、目前已报道多种用于区分滑液支原体ms-h株和野生株的方法，如基于obg基因(367nt snp位点)或oppf基因(468nt移码突变)建立的高分辨溶解曲线分析、荧光定量pcr方法和间接elisa等方法，基于vlha基因prr区和rⅲ区序列分析的靶基因测序法，基于管家基因的mlst法等。但是，靶基因测序法和mlst法比较费时费力，其他方法简单快速，但研究发现，部分ms-h再分离株obg、oppf基因型或表型可恢复为野生株，故基于该位点建立的检测方法结果存在误差(klose s m,olaogun o m,disint j f,et al.genomic diversityof a globally used,live attenuated mycoplasma vaccine[j].microbiologyspectrum,2022,10(6):e0284522.)。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种鉴别滑液支原体疫苗株ms-h与野生株的试剂盒及检测方法。本发明通过对ms-h再分离株测序结果与亲本株86079/7ns的比较，发现编码血凝素c结构蛋白(haemolysin c)基因hlyc 428nt(ms-h，cp021129，481287nt)处疫苗株ms-h及其再分离株(ms-h3、ms-h4、ms-h5、101546、101731、as2、ab1、ts4)为a碱基，亲本株86079/7ns为g碱基，推测snp位点可能为ms-h株及其再分离株特有的变异位点。因此，基于该位点(a/g)建立实时荧光定量pcr检测方法，对区分疫苗株ms-h和野生株具有实际意义。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种鉴别滑液支原体疫苗株ms-h与野生株的试剂盒，所述试剂盒包括：特异性引物hlyc-f、特异性引物hlyc-r、特异性ms-h株探针vp和特异性野生株探针wp；

3、所述特异性引物hlyc-f的核苷酸序列如seq id no.1所示；

4、所述特异性引物hlyc-r的核苷酸序列如seq id no.2所示；

5、所述特异性ms-h株探针vp的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述探针的5'端标记有fam报告基团，3'端标记有mgb荧光淬灭基团；

6、所述特异性野生株探针wp的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述探针的5'端标记有vic报告基团，3'端标记有mgb荧光淬灭基团。

7、优选地，所述试剂盒还包括两种阳性标准品、2×aceq qpcr probe master mix、50×rox reference dye 2和无菌无酶水。

8、优选地，所述两种阳性标准品分别为含有滑液支原体疫苗株ms-h株和野生株xl3株完整hlyc基因片段的质粒。

9、本发明还提供了一种利用所述试剂盒检测滑液支原体疫苗株ms-h与野生株的方法，该方法包括以下步骤：

10、s1、提取待检测样品的基因组dna；

11、s2、将疫苗株ms-h和野生株阳性标准品质粒从109拷贝/μl到100拷贝/μl梯度稀释作为模板，以所述引物和探针进行荧光定量pcr扩增，以模板拷贝数稀释度为横坐标，ct值为纵坐标，建立疫苗株ms-h和野生株的实时荧光定量pcr标准曲线；

12、s3、以s1得到的待检测样品基因组dna为模板，用特异性引物hlyc-f、特异性引物hlyc-r、特异性ms-h株探针vp和特异性野生株探针wp进行荧光定量pcr扩增；

13、s4、将s3得到的pcr产物无害化处理，收集检测结果和荧光信号，根据s2得到的疫苗株ms-h和野生株的实时荧光定量pcr标准曲线对待检样本中的病毒含量进行定量。

14、优选地，s2和s3所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：2×aceq qpcr probemaster mix 10μl，50×rox reference dye 20.4μl、10μm特异性引物hlyc-f 0.6μl、10μm特异性引物hlyc-r 0.6μl，10μm特异性ms-h株探针vp 0.5μl，10μm特异性野生株探针wp0.5μl，模板dna溶液2μl，无菌无酶水5.4μl；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火34s，40个循环。

15、本发明还提供了一种所述试剂盒的应用，所述试剂盒用于鉴别滑液支原体疫苗株ms-h与野生株。

16、本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：

17、1、本发明提供了一种鉴别滑液支原体疫苗株ms-h与野生株的试剂盒，可以精准区分疫苗株ms-h和野生株，100％排除假阳性现象。

18、2、本发明是首次基于hlyc基因建立区分疫苗株ms-h和野生株的方法，根据hlyc基因428nt处的snp变异位点建立了实时荧光定量pcr检测方法；与传统pcr测序技术相比，该方法具有方便、快捷、特异性强、重复性好的特点，且检测效率更高，能够100％区分疫苗株ms-h和野生株，对于在免疫鸡群中同时检测ms-h株和野生株具有实际意义。

19、下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

技术特征：

1.一种鉴别滑液支原体疫苗株ms-h与野生株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：特异性引物hlyc-f、特异性引物hlyc-r、特异性ms-h株探针vp和特异性野生株探针wp；

2.根据权利要求1所述的一种鉴别滑液支原体疫苗株ms-h与野生株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括两种阳性标准品、2×aceq qpcr probe master mix、50×roxreference dye 2和无菌无酶水。

3.根据权利要求2所述的一种鉴别滑液支原体疫苗株ms-h与野生株的试剂盒，其特征在于，所述两种阳性标准品分别为含有滑液支原体疫苗株ms-h株和野生株xl3株完整hlyc基因片段的质粒。

4.一种利用权利要求1-3任一权利要求所述试剂盒检测滑液支原体疫苗株ms-h与野生株的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，s2和s3所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：2×aceq qpcr probe master mix 10μl，50×rox reference dye 20.4μl、10μm特异性引物hlyc-f 0.6μl、10μm特异性引物hlyc-r 0.6μl，10μm特异性ms-h株探针vp 0.5μl，10μm特异性野生株探针wp 0.5μl，模板dna溶液2μl，无菌无酶水5.4μl；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火34s，40个循环。

6.一种如权利要求1-3任一权利要求所述试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于鉴别滑液支原体疫苗株ms-h与野生株。

技术总结
本发明提供了一种鉴别滑液支原体疫苗株MS‑H与野生株的试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物hlyC‑F、特异性引物hlyC‑R、特异性MS‑H株探针VP、特异性野生株探针WP、两种阳性标准品、2×AceQ qPCR Probe Master Mix、50×ROX Reference Dye 2和无菌无酶水；本发明还提供了利用所述试剂盒检测滑液支原体疫苗株MS‑H与野生株的方法，该方法是首次基于hlyC基因建立区分疫苗株MS‑H和野生株的方法。本发明利用hlyC基因428nt处的SNP变异位点建立的实时荧光定量PCR检测方法，具有方便、快捷、特异性强、重复性好的特点，且检测效率高，能够100％区分疫苗株MS‑H和野生株。

技术研发人员：许金朋,刘子卿,周守长
受保护的技术使用者：河北工程大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15