本发明属于化学工程与工艺，具体涉及一种分离纯化辅酶q10的方法。
背景技术：
1、辅酶q10又名泛醌10，因其母核六位上的侧链聚异戊烯基的聚合度为10而得名。辅酶q10是一种脂溶性醌，易溶解于橄榄油、维生素e、甘油三酯和多种有机溶剂，微溶于乙醇，不溶于水。辅酶q10分子式为c59h90o4，分子量为863.36，化学名为2-(3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-癸甲基-2,6,10,14,18,22,26,30,34,38-四十癸烯基)-5,6-二甲氧基-3-甲基-p-苯醌。辅酶q10是一种黄色至橙黄色晶体粉末，熔点为48-50℃。辅酶q10光照条件下易分解，在碱性条件下易降解，酸性条件下相对稳定，受温度、湿度影响较小。1957年，美国威斯康星大学的crane教授等从牛心脏细胞线粒体中分离得到辅酶q10，发现其参与线粒体内电子传递。1958年，wolf博士和folkers博士等确定了辅酶q10的结构。1959年，ruegg r等首次合成了辅酶q10。1963年，日本科学家开始开展辅酶q10的应用研究，随着研究得深入，辅酶q10的作用获得了认可，很多日本人开始每天服用辅酶q10。20世纪70年代，日本人开始寻找生产辅酶q10的廉价方法，并最终成功地找到了一种更具成本效益的工艺，辅酶q10价格开始下降。随着辅酶q10变得越来越容易获得，研究不断升温。1978年，英国科学家peter mitchell因其关于辅酶q10的作用和线粒体中能量转移的假说而获得诺贝尔奖。1986年，folkers博士因其对辅酶q10的研究而被授予美国化学学会著名的pries tly奖章。
2、辅酶q10在人体内主要有两个作用，一是在营养物质于线粒体内转化为能量的过程中起重要的作用，是细胞线粒体中的能量转换剂，它通过转移和传递电子参与“三羧酸循化”产生atp(三磷酸腺苷)，供细胞代谢使用。二是有明显的抗脂质过氧化作用，辅酶q10是有效的抗氧化剂和自由基清除剂，它将氢原子从其羟基转给脂质过氧化自由基，因而减少线粒体内膜的脂质过氧化物反应。辅酶q10作为线粒体呼吸链的组成部分包埋在线粒体内膜脂质双分子中，从线粒体复合体i或复合体ii接受2个电子后变成醇式，再将电子传递给复合体iii。在人体内辅酶q10被大量消耗变成醇式，它既是有效的抗氧化剂，同时也是运动的电子载体，在此过程中生成了与辅酶q10和辅酶q10的醇式不成比例的自由基泛半醌，或与氧发生反应形成超氧化物，自由基泛半醌在超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的作用下转运自由基实现解毒作用，如此循环往复呼吸链将辅酶q10不断再生成醇式，恢复了它的抗氧化剂活性作用。在医学上，辅酶q10还能大幅度改善人体细胞的用氧功能、营养功能和免疫增强功能，是一种很好的临床生化药物，可以提高机体的免疫力，常用于充血性心力衰竭、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、心肌缺血、高血压、心律失常等，效果良好，无毒副作用。辅酶q10。此外，还具有增强抗氧化、保护皮肤、保养青春、增强活力等功效，也已广泛用于化妆品领域。在食品领域，辅酶q10具有延缓衰老和增强免疫力的作用，经常作为功能性药物和保健食品添加剂来使用。
3、辅酶q10是酵母细胞的胞内产物，其分离纯化首先要经过细胞破碎使产物释放出来。酵母细胞膜主要由蛋白质和脂质构成，强度较差，因而细胞壁是细胞破碎的主要阻力。酵母的细胞壁主要成分是葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质，壁厚约为70nm。根据细胞破碎的方式不同，辅酶q10的提取方法有皂化法、溶剂萃取法、超声波法、研磨法、酸热法及一些新型分离方法，如分子蒸馏法、超临界萃取法。辅酶q10的分离纯化方法包括硅胶柱层析法、活性氧化铝柱层析法、大孔树脂吸附层析法、高速逆流色谱法、高效液相色谱法等等。大孔吸附树脂是一种有机高聚物吸附剂，在纯化过程中，一般首先将含有辅酶q10的粗酶液通过大孔吸附树脂进行吸附，利用较高极性溶剂除去杂质，再利用正己烷溶液洗脱达到纯化辅酶q10的目的。高速逆流色谱法和高效液相色谱法也可以用来分离纯化辅酶q10，与工业上常用的硅胶柱层析法相比，高速逆流色谱法在辅酶q10的纯度和回收率方面领先，分离效率高、溶剂用量少，但成本较高。
4、在fda允许辅酶q10作为膳食补充剂和功能性是添加剂后，辅酶q10销售增长迅猛。随着辅酶q10生产技术的发展，售价持续下降。因此，急需一条环境友好，收率更高，生产成本更低的分离纯化工艺。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分离纯化辅酶q10的方法。
2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种分离纯化辅酶q10的方法，所述分离纯化辅酶q10的方法包括：
4、(1)将含有辅酶q10的菌体进行破碎，进行有机溶剂萃取，萃取液经过陶瓷超滤膜过滤，得到透过液a；
5、(2)将透过液a经过耐有机溶剂纳滤膜过滤，得到透过液b；
6、(3)将透过液b经过耐有机溶剂纳滤膜过滤，得到浓缩液；
7、(4)将浓缩液与丙酮混合，进行冷冻结晶，得到辅酶q10。
8、本发明所述方法自动化程度高，绿色健康，voc排放远低于常规方法，辅酶q10总收率高，大于90％，产品纯度高，质量稳定，纯度大于99.9％，适于工业化生产。
9、优选地，步骤(1)中含有辅酶q10的菌体由包括以下步骤制得：
10、调节含有辅酶q10的菌体发酵液的ph至3-5，用全自动高压板框收集含有辅酶q10的湿菌体。
11、所述含有辅酶q10的菌体发酵液的ph的可以为3、3.3、3.5、4、4.4、4.8、5等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
12、优选地，所述含有辅酶q10的湿菌体中的水分含量是30-50％。
13、所述含有辅酶q10的湿菌体中的水分含量可以为30％、34％、36％、38％、40％、43％、45％、48％、50％等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
14、优选地，步骤(1)所述破碎包括将含有辅酶q10的菌体进行高压匀浆破碎。
15、优选地，步骤(1)中所述有机溶剂包括丙酮和正己烷。
16、优选地，步骤(1)所述有机溶剂中正己烷的体积占比为2％-20％。
17、所述有机溶剂中正己烷的体积占比可以为2％、4％、6％、8％、10％、14％、17％、20％等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
18、优选地，步骤(1)所述萃取有机溶剂与菌体的体积比为(3-10):1。
19、步骤(1)所述萃取有机溶剂与菌体的体积比可以为3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1等，上述比值范围的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
20、优选地，步骤(1)所述萃取的温度为20-50℃。
21、步骤(1)所述萃取的温度可以为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
22、优选地，步骤(1)所述萃取过程中辅酶q10的浓度控制在5-50mg/ml。
23、步骤(1)所述萃取过程中辅酶q10的浓度可以控制在5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、45mg/ml、50mg/ml。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
24、优选地，步骤(1)所述透过液a中辅酶q10的浓度控制在2-20mg/ml。
25、步骤(1)所述透过液a中辅酶q10的浓度可以控制在2mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、13mg/ml、15mg/ml、18mg/ml、20mg/ml。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
26、优选地，步骤(1)所述萃取液经过陶瓷超滤膜过滤包括以下步骤：
27、连续向萃取罐中补加有机溶剂，直到萃取液中辅酶q10的浓度为0.01-0.2mg/ml时停止补加有机溶剂，将全部萃取液进行陶瓷超滤膜过滤。
28、所述萃取液中辅酶q10的浓度可以为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.08mg/ml、0.10mg/ml、0.13mg/ml、0.15mg/ml、0.18mg/ml、0.20mg/ml等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
29、优选地，步骤(1)所述有机溶剂的温度为20-50℃。
30、步骤(1)所述有机溶剂的温度可以为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
31、优选地，步骤(1)所述有机溶剂包括正己烷和丙酮的组合。
32、优选地，步骤(1)所述有机溶剂中正己烷的体积占比为2％-20％。
33、步骤(1)所述有机溶剂中所述有机溶剂中正己烷的体积占比可以为2％、4％、6％、8％、10％、14％、17％、20％等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
34、优选地，步骤(1)所述透过液a中辅酶q10的浓度为2-20mg/ml。
35、步骤(1)所述透过液a中辅酶q10的浓度可以为2mg/ml、5mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、18mg/ml、20mg/ml等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
36、优选地，步骤(2)所述耐有机溶剂纳滤膜的截留量为1800-2200da。
37、步骤(2)所述耐有机溶剂纳滤膜的截留量为1800da、1900da、2000da、2100da、2150da、2200da等。
38、优选地，步骤(2)所述萃取的温度为20-50℃。
39、步骤(2)所述萃取的温度可以为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
40、优选地，步骤(2)所述萃取的过程中萃取液中辅酶q10的浓度为0.01-0.2mg/ml。
41、步骤(2)所述萃取的过程中萃取液中辅酶q10的浓度可以为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.08mg/ml、0.10mg/ml、0.13mg/ml、0.15mg/ml、0.18mg/ml、0.20mg/ml等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
42、优选地，步骤(2)所述透过液b中辅酶q10的浓度为2-20mg/ml。
43、步骤(2)所述透过液b中辅酶q10的浓度可以为2mg/ml、5mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、18mg/ml、20mg/ml等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
44、优选地，所述的分离纯化辅酶q10的方法步骤(3)温度应控制在20-50℃；
45、步骤(3)所述温度可以为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
46、优选地，步骤(3)所述浓缩液中含有不超过1％的正己烷。
47、步骤(3)所述浓缩液中的正己烷的百分含量可以为0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
48、优选地，步骤(3)所述浓缩液中辅酶q10的浓度为2-5mg/ml。
49、步骤(3)所述浓缩液中辅酶q10的浓度可以为2mg/ml、2.3mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
50、优选地，步骤(3)所述耐有机溶剂纳滤膜截留量为250-450da。
51、步骤(3)所述耐有机溶剂纳滤膜截留量可以为250da、255da、270da、300da、350da、400da、430da、450da等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
52、优选地，步骤(3)所述耐有机溶剂纳滤膜过滤后液体积减小到初始体积的1/6-1/4时，补充1/6-1/4初始体积的丙酮，得到浓缩液。
53、步骤(3)所述耐有机溶剂纳滤膜过滤后液体积减小到初始体积的量与丙酮的量独立地可以为初始体积的1/6、2/11、1/5、2/9、3/13、1/4等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
54、优选地，步骤(4)所述冷冻结晶包括以下步骤：
55、在结晶罐中以转速10-100r/min进行搅拌，将浓缩液的温度冷却到-2-2℃时开始进行结晶，继续以转速10-100r/min进行搅拌，10-20min/℃的速率继续降温至-12～-8℃，结晶总时长5-10h，即得辅酶q10。
56、所述结晶罐中的转速分别可以独立为10r/min、20r/min、30r/min、40r/min、50r/min、70r/min、90r/min、100r/min等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
57、所述浓缩液的温度冷却到开始进行结晶的温度可以为-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
58、所述降温速率的具体点值可以为10min/℃、12min/℃、14min/℃、15min/℃、17min/℃、19min/℃、20min/℃等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
59、所述降温至的温度可以为-12℃、-11℃、-10℃、-9℃、-8℃等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
60、所述结晶总时长可以为5h、5.5h、6h、6.5h、7h、8h、9h、10h等。上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
61、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
62、本发明所述方法自动化程度高，绿色健康，voc排放远低于常规方法，辅酶q10总收率高，大于90％，产品纯度高，质量稳定，纯度大于99.9％，适于工业化生产。