一种耐热α-L-鼠李糖苷酶及其耐糖突变体和应用

本发明属于基因工程及酶工程，具体涉及到一种耐热α-l-鼠李糖苷酶及其耐糖突变体和应用。

背景技术：

1、α-l-鼠李糖苷酶(α-l-rhamnosidase，ec 3.2.1.40)是一种能够特异性地水解多种糖苷键型的外切糖苷水解酶，能够水解许多天然的植物提取成分，如橘皮苷、柚皮苷、朝霍定c、淫羊藿苷等糖苷类物质，其主要的功能和作用包括脱苦、增香、生物转化等，从而提高天然活性物质的生物利用度，可用于食品、医药等领域。

2、淫羊藿为小檗科淫羊藿属的多年生草本植物，其多组分黄酮类化合物如淫羊藿苷、朝霍定c、朝霍定a、朝霍定b具有多种活性功能。淫羊藿次苷i，为淫羊藿的天然化学成分，其具有促进人体细胞产生γ-干扰素，能够显著提高人体的免疫力，并且在防治肺结核、流感、乙肝等感染性疾病，以及肿瘤的免疫治疗方面具有重要的应用前景。此外，淫羊藿次苷i属于传统中药的有效成分，毒副作用小，使用安全。与淫羊藿次苷i的结构相比，淫羊藿苷在r2位上多一个鼠李糖，且是通过α-1-糖苷键连接的鼠李糖。如果能将淫羊藿苷的r2位上通过α-1-糖苷键连接的鼠李糖特异性切除，就可以将淫羊藿苷转化成淫羊藿次苷i。由此可见，筛选获得能特异性降解鼠李糖连接的α-1-糖苷键，对生物催化朝淫羊藿苷及其它含有通过α-1-糖苷键连接的鼠李糖的天然产物具有重要意义。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

3、本发明的其中一个目的是提供一种耐热α-l-鼠李糖苷酶，从dictyoglomusthermophilum dsm 3960基因组中克隆得到的gh72家族耐热的α-l-鼠李糖苷酶dthrha，与现有技术相比具有优良的耐热性能，在95℃、ph6.5的条件下酶活性最高，在80℃下保温2h酶活基本保持不变。

4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种耐热α-l-鼠李糖苷酶，编码所述耐热α-l-鼠李糖苷酶的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述耐热α-l-鼠李糖苷酶在95℃、ph6.5的条件下酶活性最高。

5、本发明的另一个目的是提供如上所述的耐热α-l-鼠李糖苷酶的耐糖突变体，所述耐糖突变体是将所述耐热α-l-鼠李糖苷酶氨基酸序列的第479位的谷氨酸替换为丝氨酸、组氨酸、精氨酸中的一种获得。

6、本发明的另一个目的是提供编码如上所述的耐热α-l-鼠李糖苷酶或如上所述的耐糖突变体的基因。

7、作为本发明编码如上所述的耐热α-l-鼠李糖苷酶或如上所述的耐糖突变体的基因的一种优选方案，其中：所述耐糖突变体是将所述耐热α-l-鼠李糖苷酶氨基酸序列的第479位的谷氨酸替换为丝氨酸获得，其核苷酸序列如seq id no.3所示；

8、或，所述耐糖突变体是将所述耐热α-l-鼠李糖苷酶氨基酸序列的第479位的谷氨酸替换为组氨酸获得，其核苷酸序列如seq id no.4所示；

9、或，所述耐糖突变体是将所述耐热α-l-鼠李糖苷酶氨基酸序列的第479位的谷氨酸替换为精氨酸获得，其核苷酸序列如seq id no.5所示。

10、本发明的另一个目的是提供一种重组质粒，所述重组质粒包含如上所述的基因序列。

11、本发明的另一个目的是提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的重组质粒。

12、作为本发明宿主细胞的一种优选方案，其中：所述宿主细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸菌中的一种。

13、本发明的另一个目的是提供一种表达如上所述的耐热α-l-鼠李糖苷酶或如上所述的耐糖突变体的重组大肠杆菌。

14、本发明的另一个目的是提供如上所述的耐糖突变体在转化淫羊藿苷中的应用。

15、作为本发明耐糖突变体在转化淫羊藿苷中的应用的一种优选方案，其中：以淫羊藿苷为底物，目标产物为淫羊藿次苷i；

16、其中，底物与耐糖突变体的添加比例为每克底物添加耐糖突变体0.2～5u，反应温度为65～95℃，ph为4.5～7.5，反应时间为0.5～4h。

17、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

18、本发明从dictyoglomus thermophilum dsm 3960基因组中克隆得到一种耐热α-l-鼠李糖苷酶基因，与现有技术相比，本发明所提供的α-l-鼠李糖苷酶dthrha具有优良的耐热性能，在95℃、ph6.5的条件下酶活性最高。该酶具有良好的耐热性能，在80℃下保温2h酶活基本保持不变。该酶适用于70℃以上高温、偏中性条件下的水解，具有潜在的应用价值。

19、对耐热的α-l-鼠李糖苷酶dthrha进行耐糖关键位点突变，并利用突变体高效转化淫羊藿苷生成淫羊藿次苷i。本发明获得的新型α-l-鼠李糖苷酶dthrha耐糖突变体，其耐糖系数提高了2.3倍以上；该突变体能够特异性水解淫羊藿苷的r2位上通过α-1糖苷键连接的鼠李糖，且最适作用温度高，有利于提高底物的溶解度；酶法转化，安全高效，酶解时间短，得率高。

技术特征：

1.一种耐热α-l-鼠李糖苷酶的耐糖突变体，其特征在于：所述耐糖突变体是将耐热α-l-鼠李糖苷酶氨基酸序列的第479位的谷氨酸替换为丝氨酸、组氨酸、精氨酸中的一种获得；

2.编码如权利要求2所述的耐糖突变体的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述耐糖突变体是将所述耐热α-l-鼠李糖苷酶氨基酸序列的第479位的谷氨酸替换为丝氨酸获得，其核苷酸序列如seq id no.3所示；

4.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含权利要求2或3所述的基因序列。

5.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求4所述的重组质粒。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸菌中的一种。

7.一种表达如权利要求2所述的耐糖突变体的重组大肠杆菌。

8.如权利要求1所述的耐糖突变体在转化淫羊藿苷中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：以淫羊藿苷为底物，目标产物为淫羊藿次苷i；

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：底物与耐糖突变体的添加比例为每克底物添加耐糖突变体5u，反应温度为80℃，ph为5.5，反应时间为2h。

技术总结
本发明公开了一种耐热α‑L‑鼠李糖苷酶及其耐糖突变体和应用，属于基因工程及酶工程技术领域。本发明从Dictyoglomus thermophilum DSM 3960基因组中克隆得到一种耐热α‑L‑鼠李糖苷酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，与现有技术相比，本发明所提供的α‑L‑鼠李糖苷酶DthRha具有优良的耐热性能，对耐热的α‑L‑鼠李糖苷酶DthRha进行耐糖关键位点突变，获得的新型α‑L‑鼠李糖苷酶DthRha耐糖突变体，其耐糖系数提高了2.3倍以上，该突变体能够特异性水解淫羊藿苷的R2位上通过α‑1糖苷键连接的鼠李糖，能够利用突变体高效转化淫羊藿苷生成淫羊藿次苷I。

技术研发人员：赵林果,李琦,张珊珊,张洋洋,王振中,王小宇,刘栋
受保护的技术使用者：南京林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15