一种靶向乙肝表面抗原的T细胞受体工程化T细胞

本发明涉及一种靶向乙肝表面抗原的t细胞受体工程化t细胞，属于生物。

背景技术：

1、乙型病毒性肝炎（viral hepatitis type b, 简称乙肝）是由乙型肝炎病毒（hepatitis b virus, hbv）感染引起的以肝脏病变为主的一种传染病，其临床表现主要为乏力、畏食、恶心、腹胀、肝区疼痛等症状，其病理特征主要为肝大，质地为中等硬度，有轻压痛，病情重者可伴有慢性肝病面容、蜘蛛痣、肝掌、脾大，肝功能可异常或持续异常。乙肝分为慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis b, chb）和急性病毒型乙型肝炎（acutehepatitis b, ahb）两种。其中，慢性乙型病毒性肝炎会在多种因素诱导下向肝癌进展（参见文献：国际肝胆胰协会中国分会, 中国抗癌协会肝癌专业委员会, 中国研究型医院学会肝胆胰外科专业委员会, 中国研究型医院学会病毒肿瘤学专业委员会. 乙肝病毒相关肝细胞癌抗病毒治疗中国专家共识（2023版）. 中华消化外科杂志 2023, 22(1): 29-41.）。

2、研究表明，乙型肝炎病毒相关肝癌的发生除了受地域的影响外，还与慢性乙型病毒性肝炎患者体内hbsag、hbeag及hbv dna水平等因素密切相关。慢性乙型病毒性肝炎患者体内固有免疫和适应性免疫功能均低下，不能有效地清除肝细胞内的乙型肝炎病毒产物，同时，乙型肝炎病毒持续复制和炎症通路活化，均会导致慢性肝脏损伤，进而诱发肝癌（参见文献：iannacone m, guidotti lg. immunobiology and pathogenesis of hepatitisb virus infection. nat rev immunol 2022, 22(1): 19-32.）。因此，慢性乙型病毒性肝炎患者需要进行长期的抗病毒治疗及慢性乙型病毒性肝炎进展的终末期肝病的综合治疗以避免乙型肝炎病毒相关肝癌的发生。

3、现阶段，通常使用恩替卡韦（etv）、富马酸替诺福韦二吡呋酯（tdf）和富马酸丙酚替诺福韦（taf）等核苷(酸)类（nucleos(t)ide analogues，nas）抗病毒药物控制hbv病毒复制，亦可使用干扰素α（ifn-α）进行抗病毒治疗。但是，这些一线药物并不足以恢复慢性乙型病毒性肝炎患者有效的免疫调节能力，并且，停药后容易复发（参见文献：yardeni d,ghany mg. review article: hepatitis b-current and emerging therapies. alimentpharm ther 2022, 55(7): 805-819.）。因此，亟需找到能够持续有效的控制乙型肝炎病毒复制的药物，以克服现有一线药物存在的缺陷。

4、t细胞免疫应答在控制包括乙型肝炎病毒在内的多种病毒感染中发挥关键作用（参见文献：meidani m, khorvash f, hemati s, ashrafi f, ataei b, daneshmand d.the immune response of vaccination against hepatitis b virus in iranianpatientsundergoing chemotherapy. adv biomed res-india 2017, 6: 88.）。t细胞识别病毒的关键元件即t细胞抗原受体（tcr）。t细胞通过乙型肝炎病毒特异性的t细胞抗原受体识别被乙型肝炎病毒感染的肝细胞从而清除乙型肝炎病毒病毒进而控制乙型肝炎病毒感染（参见文献：ye b, liu x, li x, kong h, tian l, chen y. t-cell exhaustion inchronic hepatitis b infection: current knowledge andclinical significance.cell death dis 2015, 6(3): e1694.）。而慢性乙型肝炎病毒感染时，广泛存在乙型肝炎病毒特异性t细胞的失能、耗竭或功能失调，进而导致乙型肝炎病毒持续感染（参见文献：jiang d, chen c, yan d, zhang x, liu x, yan d, cui d, yang s. exhaustedphenotype of circulating cd8(+) t cell subsets in hepatitis b virus carriers.bmc immunol 2022, 23(1): 18.）。可见，恢复乙型肝炎病毒特异性t细胞对于持续有效的控制乙型肝炎病毒病毒复制，进而预防和/或治疗乙肝和乙型肝炎病毒相关肝癌至关重要。但是，目前尚未有基于t细胞抗原受体的能够持续有效的抑制乙型肝炎病毒复制的药物上市。因此，亟需找到基于乙型肝炎病毒特异性t细胞抗原受体的能够持续有效的治疗乙型肝炎病毒感染的药物。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种特异性识别hbsag183-191肽段（hbsag183-191肽段的氨基酸序列如seq id no.1所示）的hla-a02限制性t细胞抗原受体（hbs183tcr），所述t细胞抗原受体的α链可变区包括氨基酸序列如seq id no.2所示的cdr1、氨基酸序列如seq idno.3所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.4所示的cdr3，β链可变区包括氨基酸序列如seq id no.5所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.6所示的cdr2和氨基酸序列如seq idno.7所示的cdr3。

2、t细胞抗原受体是t细胞识别靶细胞表面特异性抗原的蛋白分子，由α链和β链（分别由tra和trb编码）或者γ链和δ链（分别由trg和trd编码）构成的异二聚体，主要是以α链和β链构成的异二聚体为主，α链和β链或者γ链和δ链之间由二硫键连接，α链由v区（可变区）、j区和c区3个基因片段重组的基因进行编码，β链由v区（可变区）、d区、j区和c区4个基因片段重组的基因进行编码。t细胞抗原受体α链和β链的v区（可变区）包含互补决定区（complement-determiningregions, cdrs）和抗体骨架区（framework region, fr），其中，cdrs的氨基酸序列决定了该抗体结合抗原的特异性，fr的主要作用是稳定cdrs的空间构型，以利于cdrs与抗原决定簇间的结合。

3、在本发明的一种实施方式中，所述t细胞抗原受体的α链可变区包括氨基酸序列如seq id no.8所示的fr1、氨基酸序列如seq id no.9所示的fr2、氨基酸序列如seq idno.10所示的fr3和/或氨基酸序列如seq id no.11所示的fr4，β链可变区包括氨基酸序列如seq id no.12所示的fr1、氨基酸序列如seq id no.13所示的fr2、氨基酸序列如seq idno.14所示的fr3和/或氨基酸序列如seq id no.15所示的fr4。

4、在本发明的一种实施方式中，所述t细胞抗原受体的α链可变区包括氨基酸序列如seq id no.8所示的fr1、氨基酸序列如seq id no.9所示的fr2和氨基酸序列如seq idno.10所示的fr3和氨基酸序列如seq id no.11所示的fr4，β链可变区包括氨基酸序列如seq id no.12所示的fr1、氨基酸序列如seq id no.13所示的fr2、氨基酸序列如seq idno.14所示的fr3和氨基酸序列如seq id no.15所示的fr4。

5、在本发明的一种实施方式中，所述t细胞抗原受体的α链的氨基酸序列如seq idno.16所示，β链的氨基酸序列如seq id no.17所示。

6、本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述hla-a02限制性t细胞抗原受体。

7、在本发明的一种实施方式中，编码所述t细胞抗原受体的α链的基因的核苷酸序列如seq id no.18所示，编码所述t细胞抗原受体的β链的基因的核苷酸序列如seq id no.19所示。

8、本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。

9、在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体或腺病毒表达载体。

10、在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pcdh-ef1α慢病毒表达载体。

11、在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的核苷酸序列如seq id no.20所示。

12、本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞转染有上述重组质粒；或者，所述宿主细胞的基因组整合有上述基因。

13、在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞共转染有上述重组质粒以及慢病毒包装质粒。

14、在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为hek-293t细胞、jurkat细胞、nk细胞或原代人t细胞。

15、本发明还提供了一种重组病毒，所述重组病毒的基因组携带上述基因。

16、在本发明的一种实施方式中，所述重组病毒以慢病毒为载体表达上述基因。

17、在本发明的一种实施方式中，所述重组病毒的制备方法包括：将共转染有上述重组质粒以及慢病毒包装质粒的宿主细胞进行培养，得到培养液；从培养液中分离得到上述重组病毒。

18、本发明还提供了一种靶向乙肝表面抗原的t细胞受体工程化t细胞（hbs183tcr-t细胞），所述t细胞受体工程化t细胞携带上述基因，或者，所述t细胞受体工程化t细胞携带上述t细胞抗原受体。

19、在本发明的一种实施方式中，所述t细胞受体工程化t细胞的制备方法包括：使用上述重组病毒感染t细胞，得到t细胞受体工程化t细胞。

20、本发明还提供了上述hla-a02限制性t细胞抗原受体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述重组病毒或上述t细胞受体工程化t细胞在制备tcr药物，制备抑制乙型肝炎病毒复制的药物，制备预防和/或治疗乙肝的药物，或者，制备预防和/或治疗乙型肝炎病毒（hbv）相关肝癌的药物中的应用。

21、在本发明的一种实施方式中，所述tcr药物包括tcr-t细胞、tcr-nk细胞和/或可溶性tcr蛋白。

22、本发明技术方案，具有如下优点：

23、本发明提供了一种靶向乙肝表面抗原的t细胞受体工程化t细胞（hbs183tcr-t细胞），hbs183tcr-t细胞携带特异性识别hbsag183-191肽段的hla-a02限制性t细胞抗原受体（hbs183tcr），hbs183tcr的α链可变区包括氨基酸序列如seq id no.2所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.3所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.4所示的cdr3，β链可变区包括氨基酸序列如seq id no.5所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.6所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.7所示的cdr3。研究发现，hbs183tcr-t细胞可特异性识别hla-a02+t2细胞提呈的hbs183-191抗原肽并分泌细胞因子ifn-γ和tnf-α，并且，hbs183tcr-t细胞可特异性识别并杀伤整合hbv基因组hla-a02+hepg2.2.15细胞并分泌细胞因子ifn-γ。因此，hbs183tcr-t细胞在制备tcr药物，制备抑制乙型肝炎病毒复制的药物，制备预防和/或治疗乙肝的药物，或者，制备预防和/或治疗乙型肝炎病毒（hbv）相关肝癌的药物中的极具应用前景。