一种利用谷氨酸棒杆菌生产新型染料谷蓝的方法及其应用

本发明涉及一种利用谷氨酸棒杆菌生产新型染料谷蓝的方法及其应用，属于生物工程领域。

背景技术：

1、新型天然蓝色染料谷蓝(cas号为2435-59-8)是一种来自细菌的天然色素，其分子式为c10h8n4o4，结构式如下：

2、

3、天然色素具有安全、营养、保健等优点，而人工合成的谷蓝通过使用一种名为苯胺的有毒化合物化学合成来满足市场需求，对人体危害较大。为寻求更加环保温和的靛蓝合成方式，生物合成成为研究热点。基于代谢工程的天然色素的过量生产可以为这一不可持续的化学生产织物染料的问题提供解决方案。

4、在天然色素中，谷蓝是一种由单一模块类型的非核糖体多肽合成酶(nrps)编码的天然蓝色颜料。其强烈深蓝色使其成为一种有吸引力的替代织物染料。此外，谷蓝有一个简单的生物合成途径，涉及l-谷氨酰胺的两个摩尔分子的缩合，转化l-谷氨酰胺合成谷蓝。此外，谷蓝合成酶需要一个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(pptase)将辅酶a上的4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移到巯基化结构域保守的丝氨酸残基上使之活化。

5、目前已在多种细菌菌株中发现编码谷蓝合成酶的基因，包括erwiniachrysanthemi、streptomyces aureofaciens ccm 3239,streptomyces chromofuscusatcc 49982和streptomyces lavendulae.已有几项研究报道了利用异源宿主(包括大肠杆菌、酿酒酵母和恶臭假单胞菌)生产谷蓝的研究。由于谷蓝是通过两个l-谷氨酰胺残基的缩合生物合成的，因此谷氨酸棒杆菌被认为是理想的生产宿主，因为它能够大量合成l-谷氨酰胺以及其前体l-谷氨酸。此外，其他异源生产宿主，如大肠杆菌、酿酒酵母等需要额外表达pptase来产生谷蓝。谷氨酸棒杆菌具有天然的pptacg基因，无需异源表达；同时，谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)作为具有生物安全性的一种模式工业微生物，具有无致病性、不产内毒素的优势。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种生产新型天然蓝色染料谷蓝的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法。

2、本发明的第一个目的是提供一种高产谷蓝的谷氨酸棒杆菌底盘细胞，谷氨酸棒杆菌c.glutamicum atcc13032、c.glutamicum n01(所述谷氨酸棒杆菌n01保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2021931)、c.glutamicum e01(记载于cn103215198b的中国发明专利文本中)。进一步地，所述谷氨酸棒杆菌底盘细胞n01以及e01分别是l-谷氨酰胺和l-谷氨酸的高产菌株，以这两种菌株作为谷蓝的生产菌株，不需要额外添加l-谷氨酰胺或l-谷氨酸作为底物，其生产谷蓝能力远超过大肠杆菌及野生谷氨酸棒杆菌。

3、本发明提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌是以谷氨酸棒杆菌(c.glutamicum)n01或谷氨酸棒杆菌e01为宿主细胞，表达了来源于streptomyceschromofuscus atcc 49982的天然蓝色素合成酶。

4、在本发明的一种实施方式中，所述天然蓝色素合成酶的氨基酸序列如seq idno.4所示。

5、在本发明的一种实施方式中，编码所述天然蓝色素合成酶的核苷酸序列如seq idno.1所示。

6、在本发明的一种实施方式中，采用pecxk-99e为表达载体。

7、在本发明的一种实施方式中，所述天蓝蓝色素合成酶基因与载体之间添加rbs序列；所述rbs序列为5’-aaaggaggacaacc-3’。

8、本发明还提供了一种提高谷氨酸棒杆菌合成谷蓝的产量的方法，所述方法为，以谷氨酸棒杆菌(c.glutamicum)n01或谷氨酸棒杆菌e01为宿主细胞，表达了来源于streptomyces chromofuscus atcc 49982的天然蓝色素合成酶。

9、在本发明的一种实施方式中，所述天然蓝色素合成酶的氨基酸序列如seq idno.4所示。

10、在本发明的一种实施方式中，编码所述天然蓝色素合成酶的核苷酸序列如seq idno.1所示。

11、在本发明的一种实施方式中，采用pecxk-99e为表达载体。

12、在本发明的一种实施方式中，所述天蓝蓝色素合成酶基因与载体之间添加rbs序列；所述rbs序列为5’-aaaggaggacaacc-3’。

13、本发明提供了一种生产谷蓝的方法，所述方法为，采用上述重组谷氨酸棒杆菌发酵制备得到谷蓝。

14、在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将上述任一重组谷氨酸棒杆菌的种子液接种至发酵培养基中，在温度为25～30℃，转速为180～220rpm，发酵培养至菌体生长od600达到0.6-0.8时，加入iptg，在温度为25～30℃，设置不同转速180～220rpm条件下诱导发酵60h。

15、在本发明的一种实施方式中，所述种子液的制备方法为：从保存有重组菌株谷氨酸棒杆菌的固体培养基上挑取单菌落至10ml含有50μg/ml卡那霉素的bhi液体培养基当中，30℃，180rpm培养24h，即得到种子液。

16、在本发明的一种实施方式中，将所述种子液按照1％～2％的接种量接种至发酵培养基中。

17、在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包含：120g/l葡萄糖、40g/l(nh4)2so4、10ml/l玉米糖浆、2.5g/l k2hpo4、2.0g/l尿素、0.5g/l mgso4、10mg/l znso4·7h2o、20mg/l feso4·7h2o、10mg/l mnso4·h2o，ph 7.0。

18、在本发明的一种实施方式中，将种子培养液按1％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，温度为25℃，转速为180rpm，发酵培养至菌体生长od600达到0.6-0.8时，加入0.5mmiptg，在温度为25℃，设置不同转速220rpm条件下诱导发酵60h。

19、本发明提供一种表达所述天然蓝色素合成酶基因的重组菌构建方法。

20、在本发明的一种实施方式中，所述方法为，所述重组菌以谷氨酸棒杆菌为宿主，以pec-xk99e为表达载体。

21、在本发明的一种实施方式中，所述方法为，所述表达载体电转入c.glutamicumatcc13032、高产l-谷氨酰胺和l-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌n01和e01中，构建重组谷氨酸棒杆菌。

22、本发明还提供利用所述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产谷蓝染料的方法，所述方法是以l谷氨酸或l-谷氨酰胺为底物催化合成谷蓝染料。

23、本发明还提供了采用上述重组谷氨酸棒杆菌或上述方法在制备谷蓝或者含有谷蓝的产品中的应用。

24、有益效果

25、(1)本发明从streptomyces aureofaciens ccm 3239、erwinia chrysanthemi、streptomyces chromofuscus atcc 49982克隆了合成谷蓝所需的天然蓝色素合成酶基因bpsa、indc、sc-indc。通过将基因克隆在谷氨酸棒杆菌中异源表达，得到的重组谷氨酸棒杆菌能以l-谷氨酰胺为直接底物合成谷蓝。

26、(2)本发明通过rbs工程优化天然蓝色素合成酶基因bpsa、indc、sc-indc表达水平，优化后的rbs与启动子结合更强成功提高了基因表达水。同时优化了谷蓝发酵条件，确定了其在添加0.5mm iptg时最佳诱导温度和转速分别为，25℃和220rpm。

27、(3)本发明中谷氨酸棒杆菌n01是l-谷氨酰胺的高产菌株，以它作为谷蓝的新型生产菌株，不需要额外添加谷氨酰胺作为底物，在生产上其潜能大大超过大肠杆菌及野生谷氨酸棒杆菌。并且由于该色素是一种来源于谷氨酸棒杆菌的天然色素，在生产过程中无污染，且对人体无毒害，因此在未来的研究中，可以将该色素用作工业染料甚至是食品添加色素。通过谷氨酸棒杆菌c.glutamicum n01-sc-indc发酵生产谷蓝,在诱导温度25℃，iptg为0.5mm时，5l发酵罐发酵60h产量可到达52.48g/l；c.glutamicum n01/pecxk-99e-r4-sc-indc发酵60h谷蓝产量最终可达到74.16±0.41g/l。