可用于肿瘤鉴定的新型DNA甲基化标志物TAGMe-3及其用途的制作方法

本发明属于表观遗传学和生物医学领域，更具体地，本发明涉及可用于肿瘤鉴定的新型dna甲基化标志物tagme-3及其用途。

背景技术：

1、肿瘤(tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。伴随着老龄化的加剧，世界范围内肿瘤患者的数据开始不断增加，肿瘤已成为全球性的公共卫生挑战，其病因极其复杂，大多数肿瘤从病因上预防较困难；而肿瘤的发生发展是渐进的过程，多数患者就诊时已属中、晚期，失去了根本性治疗的机会。早期发现、诊断和治疗是提高治愈率、改善治疗预后的关键。因此，早期开展癌症筛查并及时干预能够有效阻断癌症进展并降低发病率和死亡率。

2、表观遗传学(epigenomics)是研究表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化，最终导致表型变化的遗传学分支学科。表观遗传学包括dna甲基化(dna methylation)、组蛋白修饰(histone modification)、基因组印记(genomic imprinting)、染色体重塑和非编码rna调控等，主要通过对基因转录或翻译过程的调控，影响其功能和特性，从而影响肿瘤的发生发展。

3、dna甲基化是基因表观遗传学修饰的一种重要方式，是指在dna甲基化转移酶(dnmt)的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至dna链中特定碱基上的化学修饰过程。在哺乳动物中，dna甲基化主要发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)岛5′端胞嘧啶上，生成为5′甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,m5c)。dna甲基化作为重要的表观遗传学现象之一，参与了各类重要的生物学过程，在调控基因表达、维持基因组稳定性、调节dna空间构象、影响染色质高级结构等方面都发挥着关键的作用。大量的研究表明，肿瘤发生的早期伴随着抑癌基因甲基化水平的升高或原癌基因甲基化水平的降低。甲基化模式的改变被认为是最先能被检测到的肿瘤相关指征，并随着肿瘤恶性程度的增加进一步改变。

4、dna异常甲基化与肿瘤的发生、发展及细胞癌变有着密切的联系，主要原因在以下几个方面：1.甲基化的cpg岛二核苷酸中的胞嘧啶以较高的频率脱氨基变成胸腺嘧啶，造成基因突变；2.抑癌基因和dna修复基因由于超甲基化而沉默；3.癌基因甲基化水平降低而活化；4.基因组总体甲基化水平降低使转座子、重复序列活化导致染色体稳定性下降。因此，dna甲基化可以作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。基于dna甲基化分子标志物的肿瘤早筛虽然逐渐获得人们的关注，但真正应用在临床的方案却少之又少，所以有关肿瘤的筛查归于特检项目。另外，现有的肿瘤标志物大多仅针对特定的肿瘤类型，可用于多癌种筛查的标志物几乎没有。

5、因此，寻找可用于诊断、预后和预测癌症发生发展的分子靶标，对于癌症的早期筛查、临床干预、以及指导患者治疗具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种表观遗传修饰相关的肿瘤标记物，利用肿瘤中标志物特异性位点异常高甲基化现象来检测肿瘤。

2、在本发明的第一方面，提供分离的多核苷酸或由其转变而来的多核苷酸在制备鉴定肿瘤的试剂或试剂盒中的用途；其中，所述的多核苷酸包括：(1)seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸tagme-3，或含有其中至少1个修饰的cpg位点的多核苷酸片段，或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中，由分离的多核苷酸转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变。

3、作为一种实施方式，所述的鉴定包括诊断、检测、筛查或预后评估。

4、作为一种实施方式，所述seq id no:1还包括其序列变体，或同源序列。

5、作为一种实施方式，所述序列变体或同源序列为与所述seq id no:1所示序列相比，具有80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、95％以上、96％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上、99.8％以上序列同一性的序列。相应地，也包括由所述序列变体或同源序列转变(非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变)而来的多核苷酸。

6、作为一种实施方式，所述修饰包括5-甲基化修饰(5mc)、5-羟甲基化修饰(5hmc)、5-醛甲基化修饰(5-fc)或5-羧甲基化修饰(5-cac)。

7、作为一种实施方式，所述由分离的多核苷酸转变而来的多核苷酸为seq id no:2所示核苷酸序列的多核苷酸。

8、作为一种实施方式，所述至少1个修饰的cpg位点为seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第1～48号的任一“cpg”或其组合(如2～48个，更具体如3，5，10，11，12，15，20，25，30，35，40，45个)；较佳地为seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第9～19号的任一cpg位点或其组合、第1～8号cpg位点或其组合、或第20～48号cpg位点或其组合。

9、作为一种实施方式，所述多核苷酸片段为seq id no:1中第302～428位或第272～458位所示核苷酸序列的多核苷酸。

10、作为一种实施方式，所述的肿瘤包括(但不限于)：呼吸系统肿瘤，消化系统肿瘤，泌尿系统肿瘤，妇科及生殖系统肿瘤，血液系统肿瘤，神经系统肿瘤，头颈部肿瘤，皮肤系统肿瘤，内分泌系统肿瘤或骨骼系统肿瘤。

11、作为一种实施方式，所述肿瘤包括：肺癌，肝癌，前列腺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，尿路上皮癌，胆道肿瘤，胃癌，乳腺癌，食管癌，脑胶质瘤，结直肠癌，白血病，胰腺癌，甲状腺癌，黑色素瘤，鼻咽癌，口腔癌，喉癌，骨肉瘤，淋巴瘤，肾细胞癌或卵巢癌。

12、作为一种实施方式，所述的鉴定肿瘤针对肿瘤(包括早期、中期或晚期的肿瘤)或其癌前病变。

13、作为一种实施方式，所述鉴定肿瘤针对的样本包括(但不限于)：组织样本、体液样本、血液样本。

14、作为一种实施方式，所述样本包括(但不限于)：石蜡包埋样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本等。

15、在本发明的另一方面，提供一种制备鉴定肿瘤的试剂的方法，包括：(a)提供分离的多核苷酸或由其转变而来的多核苷酸，包括(1)seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸tagme-3，或含有其中至少1个修饰的cpg位点的多核苷酸片段；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中所述转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变；较佳地，所述至少1个修饰的cpg位点为seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第1～48号的任一cpg位点或其组合；较佳地为seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第9～19号的任一cpg位点或其组合、第1～8号cpg位点或其组合、或第20～48号cpg位点或其组合；较佳地，所述多核苷酸片段为seq id no:1中第302～428位或第272～458位所示核苷酸序列的多核苷酸；(b)以(a)的多核苷酸作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的cpg位点修饰情况的检测试剂。

16、作为一种实施方式，所述鉴定肿瘤的试剂包括但不限于：引物，探针，芯片或试纸。

17、作为一种实施方式，对于所述靶序列，可以制备一组或多组试剂。

18、作为一种实施方式，所述的检测试剂被整合于芯片上。

19、在本发明的另一方面，提供一种特异性检测靶序列的cpg位点修饰情况的试剂或试剂组合，其中所述的靶序列是：(1)seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸tagme-3，或含有其中至少1个修饰的cpg位点的多核苷酸片段；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中所述转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变；较佳地，所述的试剂或试剂组合针对包含所述靶序列的基因序列，较佳地，所述的基因序列包括基因panel或基因群组；较佳地，所述的试剂或试剂组合包括：扩增seq id no:1所示核苷酸序列中第302～428位或第272-458位的引物。

20、作为一种实施方式，所述的试剂或试剂组合为：含有seq id no:3中第29-58位序列和seq id no:4中第28-57位序列的引物。

21、作为一种实施方式，所述的试剂或试剂组合为：seq id no:3和seq id no:4序列的引物。

22、作为一种实施方式，所述的试剂或试剂组合为：seq id no:7-16所示任一序列连接seq id no:3中第29-58位序列形成的引物，seq id no:17-26所示任一序列连接seq idno:4中第28-57位序列形成的引物。

23、作为一种实施方式，所述的试剂或试剂组合为：seq id no:27和seq id no:28所示序列的引物。

24、作为一种实施方式，所述的试剂或试剂组合为：seq id no:29和seq id no:30所示序列的引物。

25、在另一实施方式中，所述的试剂或试剂组合还包括：seq id no:5和seq id no:6序列的引物。

26、在本发明的另一方面，提供所述的试剂或试剂组合的用途，用于制备鉴定肿瘤的试剂盒。

27、在本发明的另一方面，提供一种用于进行鉴定肿瘤的试剂盒，其中包括所述的试剂或试剂组合。

28、作为一种实施方式，所述试剂盒中还可包括但不限于：dna纯化试剂，dna提取试剂，bisulfite，pcr扩增试剂。

29、作为一种实施方式，所述的试剂盒中还包括：用于标明检测操作步骤和结果判定标准的说明书。

30、在本发明的另一方面，提供一种分析待测样本的甲基化水平的方法，包括：(i)从待测样本中获取多核苷酸；和(ii)分析所提取的多核苷酸中靶序列或其片段的cpg位点修饰情况，所述的靶序列是：(1)seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸tagme-3，或含有其中至少1个修饰的cpg位点的多核苷酸片段；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中所述转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变；seq id no:1所示核苷酸序列经转变而来的多核苷酸，对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变。

31、作为一种实施方式，检测所提取的多核苷酸中靶序列的cpg位点修饰情况的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化特异pcr、甲基化敏感限制性内切酶酶切法、甲基化芯片法、qpcr法、数字pcr法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、dna富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、hplc法、massarray，或它们的组合。

32、作为一种实施方式，所述分析所提取的多核苷酸中靶序列的cpg位点修饰情况的方法包括：(i)对所提取的多核苷酸进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用bisulfite处理步骤(i)所述的核酸；和(ii)分析经(i)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。

33、作为一种实施方式，利用bisulfite处理步骤(i)所述的多核苷酸；和(ii)分析经(i)处理的多核苷酸中所述的靶序列的修饰情况。

34、作为一种实施方式，甲基化水平异常是指该多核苷酸cpg中的c发生高度甲基化。

35、作为一种实施方式，其它其他甲基化检测方法及未来新开发的甲基化检测方法也可被应用于本发明中。

36、作为一种实施方式，所述分析甲基化水平的方法不是诊断性的方法，也即其不以直接获得疾病的诊断结果为目的。

37、作为一种实施方式，所述检测样品的甲基化水平的方法为体外方法。

38、作为一种实施方式，所述甲基化敏感限制性内切酶为对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶；包括但不限于：hhai，bmgbi，haeii，rrui，taii、bsu15i、hin6i、hpych4iv、nari等其中一或多种的组合。

39、在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸或其转变而来的多核苷酸，所述的多核苷酸包括：(1)seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸tagme-3，或含有其中至少1个修饰的cpg位点的多核苷酸片段；较佳地，所述至少1个修饰的cpg位点为seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第9～19号的任一cpg位点或其组合、第1～8号cpg位点或其组合、或第20～48号cpg位点或其组合；较佳地，所述多核苷酸片段为seq id no:1中第302～428位或第272～458位所示核苷酸序列的多核苷酸；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中，由分离的多核苷酸转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变。

40、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。