产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

本发明属于免疫化学，具体涉及产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术：

1、cd276（cluster of differentiation 276，簇分化抗原276）是人类cd276基因编码的i型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，也称为b7-h3。在人类中，它由染色体15q24编码，由一个胞外区、一个跨膜区和一个短的胞内区组成，没有已知的信号基序。b7-h3存在两种亚型：2igb7-h3由一对免疫球蛋白可变区（igv）样和免疫球蛋白恒定区（igc）样胞外结构域组成，4igb7-h3包含两对相同的igv样和igc样胞外结构域，后者是人类细胞的主要亚型。

2、b7-h3靶点（cd276/b7rp-2），属于b7配体家族成员（pd-l1也属于此家族成员），b7家族的10个已知成员包括b7-1（cd80）、b7-2（cd86）、b7-h1（pd-l1）、b7-dc（pd-l2）、b7-h2（cd275）、b7-h3（cd276）、b7-h4（vtcn1）、b7-h5（vista）、b7-h6（ncr3lg1）和b7-h7（hhla2）。b7家族成员在淋巴组织和非淋巴组织上表达，并且通常在许多人类癌症组织中高度表达。b7-h3 mrna在多种正常组织（肝脏、小肠、胰腺、睾丸、心脏和结肠组织）表达，但不在人外周血白细胞中表达。然而，b7-h3蛋白表达在正常细胞、组织和失活的t淋巴细胞中保持低水平，但在活化（通过gm-csf或lps刺激）b细胞、t细胞、单核细胞或nk细胞以及多种肿瘤类型中发现b7-h3表达增加。其中，b7-h3鉴于其在各种癌症中的高表达以及与不良预后的相关性获得关注。尽管b7-h3首次被发现可通过ifn-γ的产生激活t细胞功能，但目前已更明确地表明其可通过抑制ifn-γ、il-2、il-10和il-13下调cd4+和cd8+t细胞应答。

3、b7-h3的转录本在正常组织和实体肿瘤中广泛存在，但其蛋白仅在肿瘤组织中高表达，正常组织中表达量极低。

4、大量研究已在多种恶性肿瘤中发现b7-h3表达失调，b7-h3表达失调与更具侵袭性的病程和较差的结局相关。在口腔鳞状细胞癌中，b7-h3过表达与更具侵袭性的肿瘤和更高的死亡率相关；阻断表达抑制了肿瘤生长。同样，b7-h3在前列腺癌中的表达增加与转移、复发、术后癌症进展和死亡密切相关。

5、b7-h3也被用作区分病理性和非病理性血管生成的内皮标志物。结肠癌肿瘤血管上b7-h3高表达与较差的tnm分期和不良预后相关。同样，b7-h3通常定位于细胞膜和细胞质，很少发现于细胞核。然而，在结肠癌中，b7-h3更常定位于细胞核，与癌症进展、转移和不良疾病结局相关。

6、b3-h7的功能颇受争议，且具有多面性，既可以起到免疫共刺激作用，也可以起到免疫共抑制作用。b3-h7可以影响肿瘤细胞的多重信号通路，具体有pi3k/akt，nf-κb，ras/raf/mek/mapk，jak2/stat3信号途径，还可以调节葡萄糖代谢途径。

7、最近的研究表明，b7-h3在肿瘤的生长、侵袭、迁移及血管生成和转移中起着重要作用，由于其在免疫逃逸中的作用，b7-h3已成为新的免疫治疗靶点。主要免疫治疗手段有：单抗阻断、放射免疫疗法、adc、adcc、cd3衔接的双抗、trikes、car-t/nk细胞治疗等，临床上进展较快的是macrogenics公司的依诺妥珠单抗及在此单抗基础上改造获得的b7-h3*cd3双抗（mgd009），b7-h3-adc药物（mgc018）等，daiichi sankyo公司的b7-h3-adc药物（ds-7300a）。联合治疗方面，b7-h3和pd-l1对t细胞产生抑制作用，改变t细胞的微环境以逃避抗肿瘤免疫应答。b7-h3 car-t/nk细胞已经被证明对多种癌症类型具有有效的体外抗肿瘤活性。而b7-h3和ctla4也可能有协同作用，类似于b7-h3在pd-1通路中一样。

8、免疫组织化学（immunohistochemistry，ihc）是利用抗原-抗体高度特异性结合的特点来显示组织切片中抗原的分布和定位的原位检测技术。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助组织化学的方法进行观察，如将酶偶联到抗体上，酶会催化底物在抗原位置产生有色沉淀，从而将抗原抗体结合的部位显示出来，以期达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性、定位或定量的研究。为了提高免疫组织化学的检测效率和一致性，需要筛选出高特异性的单克隆抗体，且要求这些抗体在组化检测工作中的灵敏度、特异性和准确度等指标达到一定的标准，因此筛选出各项指标均较好的抗体对病理诊断具有重要的意义。

9、目前，市场上能够特异性并高灵敏度地检测b7h3的抗体的数量极少，尤其是能够应用于免疫组织化学检测的抗b7h3单克隆体。所以制备特异性强、灵敏度高、应用范围广的抗b7h3单克隆抗体，具有重要的现实意义和应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，所述杂交瘤细胞株产生的抗b7h3单克隆抗体与b7h3蛋白具有较高的亲和力，能够特异性地识别b7h3蛋白，在制备b7h3检测试剂盒中具有重要的应用前景。以抗b7h3单克隆抗体构建的b7h3检测试剂盒灵敏度高、特异性好，在包括酶联免疫吸附、蛋白免疫印迹、免疫组织化学、流式细胞术和免疫荧光等在内的多种检测中应用效果较好。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一株产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株的分类命名为鼠抗人b7h3单克隆抗体杂交瘤细胞系，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.45550，保藏日期为2023年04月25日。

4、第二方面，本发明提供一种抗b7h3单克隆抗体，所述抗b7h3单克隆抗体由第一方面所述的产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生。

5、本发明中，所述抗b7h3单克隆抗体以b7h3蛋白为免疫原免疫动物制备获得。

6、优选地，所述抗b7h3单克隆抗体的亚型为igg1型。

7、优选地，所述抗b7h3单克隆抗体的重链包括：

8、cdr1：gftvssya，（seq id no.3）；

9、cdr2：itsggtyt，（seq id no.4）；

10、cdr3：pyggwfay，（seq id no.5）。

11、优选地，所述抗b7h3单克隆抗体的轻链包括：

12、cdr1：tgavttsny，（seq id no.6）；

13、cdr2：gtn；

14、cdr3：alwysnhwv，（seq id no.7）。

15、优选地，所述抗b7h3单克隆抗体的重链可变区包括seq id no.8所示的氨基酸序列，所述抗b7h3单克隆抗体的轻链可变区包括seq id no.10所示的氨基酸序列。

16、优选地，所述抗b7h3单克隆抗体的重链全长包括seq id no.9所示的氨基酸序列；所述抗b7h3单克隆抗体的轻链全长包括seq id no.11所示的氨基酸序列。

17、本发明中，以人b7h3重组蛋白作为免疫原免疫小鼠，取免疫后的小鼠脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，筛选能分泌高灵敏度和高特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

18、本发明中所述抗b7h3单克隆抗体的抗原为人源b7h3蛋白，所述人源b7h3蛋白包括seq id no.1所示的氨基酸序列，所述人源b7h3蛋白的氨基酸序列见uniprot genbank id：q5zpr3，相应的蛋白胞外区位于第leu29-thr461位氨基酸，并在蛋白的c末端，添加6个组氨酸组成的标签。

19、在本发明中，鼠抗人b7h3单克隆抗体杂交瘤细胞系mj22-2分泌的单克隆抗体命名为单克隆抗体mj22-2，在实际应用中，可根据需要采用已知的抗体改造方案对单克隆抗体mj22-2进行结构和序列上的改造，以获得需要的性质，对单克隆抗体mj22-2的改造包括：

20、（1）标记抗体

21、可对抗体进行标记以便于检测，标记方法可以是荧光标记、化学发光标记、放射性标记、酶联标记、生物素/亲和素标记、磁珠标记或纳米颗粒标记等。

22、（2）结构改造

23、可对抗体结构进行改造，构建成抗原亲和性类似但结构不同的分子，如fab、f(ab’)2、fab’、fab’-sh、fv片段、单链抗体（如scfv）、单域抗体、抗体偶联物、双功能抗体或多特异性抗体等。其中fab’片段是指在重链ch1结构域的羧基端添加少量氨基酸残基（包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸）的fab，fab’-sh是指在恒定区的半胱氨酸残基带有自由硫醇基的fab’。

24、优选地，对纯化后的抗b7h3单克隆抗体进行修饰，所述修饰使用的修饰缀合物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、异硫氰酸荧光素、cy3或cy5中的任意一种或至少两种的组合。

25、本发明中，所述抗b7h3单克隆抗体应用于构建b7h3检测试剂盒，或者直接应用于检测，所述抗b7h3单克隆抗体可以修饰有缀合物或检测标记，例如荧光标记、酶标记、放射性标记、生物素标记或亲和素标记等。具体的缀合物或检测标记包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、异硫氰酸荧光素、cy3或cy5等，连接方式包括化学键偶联、静电吸附或亲疏水性吸附等。

26、第三方面，本发明提供一种第二方面所述的抗b7h3单克隆抗体的制备方法，所述抗b7h3单克隆抗体的制备方法包括：

27、培养第一方面所述的产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，纯化，获得所述抗b7h3单克隆抗体。

28、本发明中，所述抗b7h3单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

29、（1）应用真核表达平台，构建真核表达质粒，在293t细胞中瞬转表达，elisa法证实蛋白能够表达，在293f细胞中扩大培养，瞬转表达，并纯化获得人源b7h3蛋白。

30、（2）用得到的真核表达的人源b7h3蛋白免疫小鼠，血清效价测定合格后，处理并获得免疫后的小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0进行融合，经过培养、亚克隆分选和筛选后，获得杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株能产生特异性识别b7h3蛋白的单克隆抗体。

31、（3）培养杂交瘤细胞株，收集培养基的上清，并进行亲和纯化，获得单克隆抗体，elisa测定单克隆抗体的活性。

32、第四方面，本发明提供第一方面所述的产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株和/或第二方面所述的抗b7h3单克隆抗体在制备b7h3蛋白表达检测产品中的应用。

33、第五方面，本发明提供一种b7h3免疫组织化学检测试剂盒，所述b7h3免疫组织化学检测试剂盒包括第二方面所述的抗b7h3单克隆抗体。

34、优选地，所述b7h3免疫组织化学检测试剂盒还包括：免疫组织化学抗原修复缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色剂或苏木素复染液中的任意一种或至少两种的组合。

35、本发明中，所述b7h3免疫组织化学检测试剂盒中的抗b7h3单克隆抗体与b7h3蛋白具有高亲和力。

36、本发明中，在所述b7h3免疫组织化学检测试剂盒中抗b7h3单克隆抗体是指能够检测组织样本中b7h3表达状态的抗体，其能够与b7h3蛋白结合，在免疫组织化学实验中，抗b7h3单克隆抗体作为一抗进行b7h3表达状态的检测。

37、第六方面，本发明提供一种b7h3免疫印迹检测试剂盒，所述b7h3免疫印迹检测试剂盒包括第二方面所述的抗b7h3单克隆抗体。

38、优选地，所述b7h3免疫印迹检测试剂盒还包括：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sds-page凝胶）、聚偏二氟乙烯膜（pvdf膜）、封闭液或酶标二抗中的任意一种或至少两种组合。

39、第七方面，本发明提供一种b7h3酶联免疫吸附检测试剂盒，所述b7h3酶联免疫吸附检测试剂盒包括第二方面所述的抗b7h3单克隆抗体。

40、优选地，所述b7h3酶联免疫吸附检测试剂盒还包括：封闭液、酶标二抗、显色液或终止液中的任意一种或至少两种组合。

41、第八方面，本发明提供一种b7h3免疫荧光检测试剂盒，所述b7h3免疫荧光检测试剂盒包括第二方面所述的抗b7h3单克隆抗体。

42、优选地，所述抗b7h3单克隆抗体修饰有荧光基团，所述荧光基团为异硫氰酸荧光素、cy3或cy5中的任意一种。

43、第九方面，本发明提供一种b7h3流式细胞术检测试剂盒，所述b7h3流式细胞术检测试剂盒包括第二方面所述的抗b7h3单克隆抗体。

44、发明中，在所述b7h3流式细胞术检测试剂盒中抗b7h3单克隆抗体是指能够检测表达b7h3蛋白的细胞中b7h3表达状态的抗体，抗b7h3单克隆抗体能够与细胞膜上的b7h3蛋白结合，在流式细胞术中，抗b7h3单克隆抗体作为一抗进行表达b7h3蛋白的细胞的检测。

45、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

46、（1）本发明提供的抗b7h3单克隆抗体能识别真核重组表达和原核重组表达的b7h3蛋白，具有检测b7h3蛋白的特性，具有广泛的用途。

47、（2）本发明提供的抗b7h3单克隆抗体为igg1亚型抗体，能够在免疫组化检测中特异性地识别肿瘤组织和正常组织中的b7h3蛋白表达，且具有较高的亲和力。

48、（3）本发明提供的抗b7h3单克隆抗体在免疫印迹检测、酶联免疫吸附检测和免疫组织化学检测中具有极高的灵敏度和特异性。