抗人CD4抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于抗体领域，具体涉及一种抗人cd4抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、cd4-t淋巴细胞是人体免疫系统中一种重要的免疫细胞，简称为cd4细胞。t淋巴细胞属于白细胞中的淋巴细胞类，在免疫系统中扮演很重要的角色。人体内有两种主要的t淋巴细胞，其中一种就称为cd4细胞，cd4主要由辅助t(th)细胞表达，是th细胞tcr识别抗原的受体，与mhcⅱ类分子的非多肽区结合，参与th细胞tcr识别抗原过程。这些cd4细胞又称为免疫系统的辅助手(helper)，能指挥身体对抗微生物，例如病毒。由于艾滋病病毒(hiv)的攻击对象正是人体的cd4细胞，因此cd4记数能够直接反映人体免疫功能，是提供hiv感染患者免疫系统损害状况最明确的指标。正常成人的cd4细胞为每立方毫米500-1600个，艾滋病病毒感染者的cd4细胞可能会出现进行性或不规则性下降，提示感染者的免疫系统受到了严重损害，当cd4细胞小于每立方毫米200个时就可能会发生多种严重性机会性感染或肿瘤。专利cn 109996815 a公开了关于针对cd4的单克隆抗体、其组合物，以及使用此组合物以预防、治疗及功能性治愈hiv感染的方法。因此，cd4检测结果对艾滋病诊断、治疗效果的判断和对患者免疫功能的判断有着重要作用。

2、在类风湿关节炎中，特异的cd4+t细胞克隆性扩增为其发病机制的研究提供了依据。早期类风湿性关节炎病人滑膜中cd4+t细胞呈寡克隆状态，随着不同病期其克隆类型也会发生改变，晚期风湿性关节病人滑膜组织中，绝大多数t细胞(包括优势亚家族t细胞)呈多克隆状态[1-2]。根据此原理，临床上使用抗cd4单克隆抗体分子治疗风湿症患者，通过减少cd4+t细胞的数量[3]，达到治疗作用。专利cn 101885769 a提供了一种全人源抗cd4抗体，该抗体分子与辅助t细胞膜上的表面抗原分化簇4(cd4抗原)特异性地结合；该抗体在制备治疗或诊断淋巴细胞瘤、艾滋病、类风湿性关节炎、同种异体器官移植排斥反应等疾病中具有潜在的应用。

3、cd4抗体是一类可以特异性结合cd4的多克隆抗体，主要用于体外检测cd4的免疫学实验。cd4抗体经常用于流式细胞术和免疫荧光应用，以识别表达cd4分子的免疫细胞亚群。已知表达cd4表面标志物的细胞包括胸腺细胞、成熟t细胞的特定亚群、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和nkt细胞。通过抗cd抗体与标记物的偶联，利用流式细胞仪和免疫监测方法，观察和计算cd分子的数量及数量变化，对于疾病及药物的机理研究，疾病的预防及诊断等领域有着重大的意义。因此，亟需开发新的cd4抗体，用以满足临床需求。

4、[1]coronzy jj,bartz2bazzanella p,hu w,et al.dominant clonotypes inthe repertoire of peripheral cd4+t cell in rheumatoid arthritis.[j].clininvest,1994,94(5):2068-2076.

5、[2]olive c,gaenby pa,serjeantson sw.analysis of t cell receptor valpha and beta gene usage in synovia of patients with rheumatoid arthritis.[j].immunol cell biol,1991,69:349-354.

6、[3]sawitzki b,lehmann m,vogt k et；bag·i up-regulation in anti-cd4mab.heated allo.activated t cell corlfcrresistance to acfivationinducedcelldeath(aicd).[j].tmnbplant immunol,2002；9(2·4):83-91.

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种抗人cd4抗体的具体氨基酸序列，通过该序列可以利用现有技术获得表达抗人cd4抗体的基因工程细胞，提高了cd4抗体的产率和生产稳定性，并且该抗体亲和力高，特异性强，对于疾病及药物的机理研究，疾病的预防及诊断具有重大意义。

2、术语：

3、本发明中，cdr(complementarity-determining regions，cdr)叫做互补决定区或互补决定簇。它位于免疫球蛋白的超变区，超变区是抗体的抗原结合位，与抗原决定簇的结构互补。一般包括cdr1、cdr2、cdr3。

4、本发明中，可变区指免疫球蛋白轻链和重链靠近n端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区。

5、本发明中，重链指抗体中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(h链)；轻链指抗体中2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(l链)。

6、本发明中，相似性指同源蛋白质的氨基酸序列中一致性和可取代氨基酸所占的比例。

7、本发明中，单克隆抗体指由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。

8、本发明中，鼠源化抗体指将来源于免疫接种过的小鼠的b细胞与骨髓瘤细胞融合，得到的鼠杂交融合细胞分泌的抗体。

9、一方面，本发明提供了一种抗人cd4抗体，所述的抗人cd4抗体包括重链和轻链，所述的重链包括重链链可变区，所述的轻链包括轻链可变区；所述的重链可变区包括hcdr1、hcdr2、hcdr3，所述的轻链可变区包括lcdr1、lcdr2、lcdr3，其中：

10、(1)hcdr1为seq id no.1所示的氨基酸序列，或seq id no.2所示的氨基酸序列；

11、(2)hcdr2为seq id no.3所示的氨基酸序列，或seq id no.4所示的氨基酸序列；

12、(3)hcdr3为seq id no.5所示的氨基酸序列，或seq id no.6所示的氨基酸序列；

13、(4)lcdr1为seq id no.7所示的氨基酸序列，或seq id no.8所示的氨基酸序列；

14、(5)lcdr2为seq id no.9所示的氨基酸序列，或seq id no.10所示的氨基酸序列；

15、(6)lcdr3为seq id no.11所示的氨基酸序列，或seq id no.12所示的氨基酸序列。

16、具体地，所述的抗人cd4抗体重链可变区的氨基酸序列为seq id no.13或与seqid no.13具有80％以上序列相似性的序列；

17、或所述的抗人cd4抗体重链可变区的氨基酸序列为seq id no.14或与seq idno.14具有80％以上序列相似性的序列；

18、所述的抗人cd4抗体轻链可变区的氨基酸为seq id no.15或与seq id no.15具有80％以上序列相似性的序列；

19、或所述的抗人cd4抗体轻链可变区的氨基酸为seq id no.16或与seq id no.16具有80％以上序列相似性的序列。

20、优选地，所述的抗人cd4抗体重链可变区氨基酸序列为seq id no.13或seq idno.14；轻链可变区氨基酸序列为seq id no.15或seq id no.16。

21、具体地，所述的抗人cd4抗体重链氨基酸序列为seq id no.17，或与seq id no.17具有65％以上序列相似性的序列；

22、或所述的抗人cd4抗体重链氨基酸序列为seq id no.18，或与seq id no.18具有65％以上序列相似性的序列；

23、所述的抗人cd4抗体轻链氨基酸序列为seq id no.19，或与seq id no.19具有65％以上序列相似性的序列；

24、或所述的抗人cd4抗体轻链氨基酸序列为seq id no.20，或与seq id no.20具有65％以上序列相似性的序列。

25、优选地，所述的抗人cd4抗体重链氨基酸序列为seq id no.17或seq id no.18，轻链氨基酸序列为seq id no.19或seq id no.20。

26、具体地，所述的抗人cd4抗体为单克隆抗体；优选为鼠源化抗体。

27、另一方面，本发明提供了表达前述的抗人cd4抗体的核苷酸序列。

28、所述的核苷酸序列可以是通过密码子简并性优化后的序列，用于编码前述的抗人cd4抗体均可。

29、优选地，重链seq id no.17和seq id no.18对应的核苷酸序列分别为seq idno.21和seq id no.22，轻链seq id no.19和seq id no.20对应的核苷酸序列分别为seqid no.23和seq id no.24。

30、再一方面，本发明提供了包括前述的核苷酸序列的表达载体。

31、所述的表达载体可以是质粒、噬菌体、病毒。

32、又一方面，本发明提供了表达前述的抗人cd4抗体或核苷酸序列或表达载体的细胞。

33、所述的细胞的作用在于可以高效表达抗人cd4抗体。

34、具体地，所述的细胞可以是hek293或cho。

35、又一方面，本发明提供了制备前述的抗人cd4抗体的方法，所述的方法中包括培养前述的细胞。

36、所述的方法中还可能包括抗体纯化步骤。

37、所述的抗体纯化步骤可以是沉淀法、广谱亲和纯化、抗原特异性纯化、离子交换法。

38、又一方面，本发明提供了对前述的抗人cd4抗体进行荧光标记的方法，所述的方法中包括使用大分子染料或小分子染料对抗人cd4抗体进行标记。

39、优选地，所述的大分子染料为apc，所述的小分子染料为fitc。

40、又一方面，本发明提供了前述的抗人cd4抗体或核苷酸序列或表达载体或细胞在cd4检测中的应用，所述的应用为非疾病诊断或治疗的应用。

41、所述的应用为通过抗体抗原结合实现。

42、所述的应用可以是检测t淋巴细胞中的cd4。

43、又一方面，本发明提供了前述的抗人cd4抗体或核苷酸序列或表达载体或细胞在制备cd4检测试剂盒中的应用。

44、具体地，所述的试剂盒中还包括其他用于cd4检测的试剂，如：缓冲液、样品处理剂。

45、具体地，所述的试剂盒中还可以包括用于荧光标记抗体的分子。

46、进一步具体地，所述的分子可以是大分子染料或小分子染料。

47、优选地，所述的大分子染料为apc，所述的小分子染料为fitc。

48、又一方面，本发明提供了一种cd4检测方法，所述的检测方法通过前述的抗人cd4抗体进行检测。

49、具体地，所述的检测方法中还可以包括样品前处理步骤。

50、所述的前处理步骤为样本的采集及处理。

51、优选地，所述的检测方法非疾病诊断或治疗方法。

52、又一方面，本发明提供了一种cd4检测试剂盒，所述的试剂盒中包括前述的抗人cd4抗体或核苷酸序列或表达载体或细胞。

53、具体地，所述的试剂盒中还包括其他用于cd4检测的试剂，如：缓冲液、样品处理剂。

54、具体地，所述的试剂盒中还可以包括用于荧光标记抗体的分子。

55、进一步具体地，所述的分子可以是大分子染料或小分子染料。

56、优选地，所述的大分子染料为apc，所述的小分子染料为fitc。

57、本发明的有益效果：

58、本发明提供了一种新的抗人cd4抗体，与cd4具有较好的结合能力和特异性，能够用于制备表达抗人cd4抗体的细胞，从而实现大量制备，为cd4的检测提供了更便利的条件。