一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法及应用与流程

本发明属于基因工程药物领域，具体涉及一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法及应用。

背景技术：

1、溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，可以通过细胞表面受体分子入侵到肿瘤细胞中，具有肿瘤治疗潜力。现有溶瘤病毒治疗的有效策略是改造出具有特异性的溶瘤病毒，并靶向肿瘤细胞中过度表达的特异性受体，将病毒入侵到肿瘤细胞中并行使后续的各项功能。

2、溶瘤病毒介导的基因治疗对肿瘤细胞杀伤效率高、特异性好、安全性高、副作用小、成本低廉，是一种新兴肿瘤免疫治疗模式。但溶瘤病毒疗法并非十全十美，目前其最大的挑战，依然在于如何提高产品的安全性和有效性。

3、申请号为201010621084.2的中国专利中公开了一种人工改造人类5型腺病毒(ad5)的构建方案，以及用该方案获取的一种新型溶瘤腺病毒构建体在肿瘤治疗中的具体用途，属于医学基因工程技术领域。用pcr扩增定点缺失、酶切、连接、克隆、同源重组、转染、腺病毒单克隆纯化等技术，获得的一种重组腺病毒构建体，特征在于：ad5基因组e1a保守序列2(cr2)区缺失27个碱基；e3区adp基因的29477-29714nt缺失；同时在该缺失区插入hsv-tk基因的全长编码序列(1131bp)。该构建体是一种具有更高的肿瘤选择性复制能力的新型溶瘤腺病毒载体，其利用hsv-tk的自杀基因作用和溶瘤病毒溶解肿瘤细胞的双重杀伤效应在肿瘤的生物治疗中具有独特的实用价值。但其肿瘤杀伤能力有限。

4、申请号为201910462073.5的中国专利中公开了：重组溶瘤病毒以及制备方法、应用和药物，涉及生物技术领域。公开的重组溶瘤病毒的基因组序列上含有如下外源元件：(1)含有第一启动子和第一干扰rna表达序列的第一表达盒；(2)靶标序列；以及(3)第二表达盒。该重组溶瘤病毒的繁殖或复制受到其基因组序列上所插入的外源元件调控，通过这些外源元件的调控，使得该重组溶瘤病毒可以在不同类型的细胞中选择性繁殖或复制，通过选择性的繁殖或复制进而可选择性地杀死第二细胞即靶细胞(例如肿瘤细胞)而对第一细胞即非靶细胞(例如正常细胞)不造成伤害。制备的重组瘤病毒作用不稳定，且肿瘤杀伤能力有进一步提升的空间。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明利用admax复制缺陷型的ad5型腺病毒载体进行基因工程改造，获得一款利用多重机制提高溶瘤病毒安全性和有效性的溶瘤病毒。

2、本发明对腺病毒骨架载体(以pbhgloxδe1,3cre为例)和穿梭载体(以pdc316为例)分别进行了改构，并利用改构后的两种载体共转染表达细胞(以293细胞为例)以制备溶瘤腺病毒。

3、admax系统的骨架载体pbhgloxδe1,3cre缺失了ad5型腺病毒的e1基因和e3基因，所以和穿梭载体如pdc316共转染293细胞制备的腺病毒不具有复制能力，即丢失了溶瘤病毒的特征。通过下面的改造，本发明恢复了病毒的复制能力，并且增强了溶瘤病毒在肿瘤杀伤作用中的高效性和安全性。

4、一方面，本发明提供了一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法。

5、所述构建方法中包括：

6、(1)在穿梭载体插入htert启动子、e1a基因区、55kd e1b相关片段和p53基因构建得到改造穿梭载体，其中：所述e1a基因区为缺少cr2区片段的e1a基因；所述55kd e1b相关片段包括缺失19kd片段的e1b基因和e1b基因启动子区，所述的缺失19kd片段的e1b基因为seq id no.1；

7、(2)对e1和e3区缺失的腺病毒的骨架载体进行改造得到改造腺病毒载体：

8、将ad5腺病毒fiber分子上的knob和shaft序列替换成ad35型腺病毒上的knob和shaft序列；并将hgm-csf基因插入骨架载体的e3缺失区；

9、(3)改造穿梭载体和改造腺病毒载体共转染细胞后表达。

10、具体地，所述的步骤(1)中：

11、所述的htert启动子为seq id no.2；

12、所述的cr2区片段为seq id no.3；

13、所述的e1b基因启动子区为seq id no.4；

14、所述的p53基因区序列为seq id no.5。

15、优选地，所述的步骤(1)中：e1a基因区为seq id no.6。

16、优选地，所述的步骤(1)中：穿梭载体为pdc316。实际上，本领域技术人员对于穿梭载体的选择不局限于本发明所优选的类型，能够实现穿梭载体功能的均可。

17、所述的步骤(2)中ad35型腺病毒上的knob和shaft序列为seq id no.7。

18、所述的步骤(2)中hgm-csf基因为seq id no.8。

19、步骤(2)中对e1和e3区缺失的腺病毒的骨架载体进行改造的步骤包括：

20、1)构建含cre酶识别位点、抗性筛选标记、ad35型病毒fiber基因上的knob和shaft功能区的载体，并通过抗性筛选获得阳性克隆；

21、2)利用表达cre重组酶的大肠杆菌进行同源重组，将添加的筛选标记敲除；

22、3)将hgm-csf基因插入骨架载体的e3缺失区。

23、所述的步骤1)中：抗性筛选标记包括抗性基因和启动子；所述的cre酶识别位点为loxp位点。

24、优选地，所述的步骤1)中：loxp序列为seq id no.9所示。

25、所述的步骤3)中：hgm-csf基因与ad5骨架序列共同插入，插入酶切位点为paci。

26、在一些实施例中，所述的步骤(1)对穿梭载体进行的改构可以包括以下步骤：

27、插入人端粒酶逆转录酶htert启动子区和受其调控的e1a基因区，序列分别如seqid no.2和seq id no.6所示；

28、插入受e1a调控的缺失19kd e1b基因及e1b基因启动子区，即55kd e1b相关片段；序列为seq id no.4-seq id no.1(表示二者连接)；

29、通过同源重组缺失e1a基因上cr2区段(24bp序列)；cr2区段如seq id no.3所示；

30、在载体多克隆位点插入p53基因。具体的序列为seq id no.5所示。

31、以上改造方式的作用在于：

32、(1)利用肿瘤特异性启动子来特异性表达e1a基因以及利用e1a基因缺失24bp序列的蛋白不能和rb分子结合的特点，进一步增强了溶瘤病毒在肿瘤细胞的特异性复制能力；

33、(2)通过缺失e1b基因的19kd分子，增强了溶瘤病毒诱导肿瘤细胞发生凋亡。

34、本发明的穿梭载体还包括：

35、在多克隆位点上插入了p53基因。p53是一种肿瘤抑制基因。在所有恶性肿瘤中，50％以上会出现该基因的突变。在肿瘤细胞中过表达野生型p53能够阻滞肿瘤细胞周期，促进细胞凋亡以及抑制肿瘤的血管生成，进而发挥p53的抑癌功能。

36、在对于穿梭载体的改构中，本发明主要通过真核细胞一步法同源重组方法或者通过合适的酶切酶连的方法来实现。

37、优选地，本发明改造的穿梭载体pdc316的质粒图谱为图1：在穿梭载体pdc316基础上插入了e1a基因并在e1a上游插入肿瘤特异性启动子htert序列，插入了受e1a调控的缺失了19kd的55kd-e1b基因以及其转录调控区(启动子)，并且缺失了e1a基因cr2上的24bp碱基；在该载体的多克隆位点插入了p53基因，基因的表达是受cmv启动子调控。该穿梭载体命名为pdc316-htert-del24e1a-55kde1b-p53。

38、在一些实施例中，所述的步骤(2)对腺病毒的骨架载体pbhgloxδe1,3cre进行的改构主要包括两个位置：

39、1)将ad5型腺病毒fiber分子上的knob和shaft序列替换成ad35型腺病毒上的knob和shaft序列；

40、2)通过同源重组的方法将hgm-csf基因插入e3缺失区，并且通过基因组内源性的启动子来调控hgm-csf的表达，启动子序列如seq id no.10所示。

41、以上改造方式的作用在于：

42、因为ad5型腺病毒入侵细胞的第一步需要和肿瘤细胞相互作用，这种相互作用是通过病毒的fiber蛋白识别肿瘤表面表达的car(coxsackie-adenovirus receptor，car)来实现的，但是在一些肿瘤细胞中由于缺乏car的表达或者低表达，继而限制了ad5型溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的识别和入侵。某些b组腺病毒如35型腺病毒可以通过非car受体如cd46来感染肿瘤细胞。cd46是一种广泛表达的膜蛋白。为了使溶瘤病毒能够对各种肿瘤产生抗肿瘤作用，本发明建立嵌合型的腺病毒fiber分子，可以和肿瘤细胞表面的cd46结合，从而实现对许多car阴性表达的肿瘤细胞的侵袭。

43、五型腺病毒的骨架质粒pbhgloxδe1,3cre完全缺失了e3基因的表达，这一段基因片段的缺失可以让我们插入外源功能基因hgm-csf。hgm-csf通过调节哺乳动物骨髓细胞生成以促进巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和吞噬细胞增殖。在免疫效应中，hgm-csf作用细胞主要是抗原提呈细胞apc(antigen presenting cell)，通过增强apc对抗原的处理和表达，以维持和增强适应性免疫反应。

44、由于五型腺病毒的骨架质粒pbhgloxδe1,3cre大小达到了34kb以上，所以用真核同源重组或者酶切酶连进行改构的技术方法是行不通的。

45、本发明优选地，通过组合多种细菌同源重组的技术进行了改构工作。

46、pbhgloxδe1,3cre改构具体如下：

47、(1)通过两步同源重组技术，将5型腺病毒fiber分子上的knob和shaft功能区替换成35型腺病毒上的knob and shaft功能区：

48、第一步是通过sw102菌同源重组将35型腺病毒上的knob和shaft功能区替换5型腺病毒fiber分子上的knob和shaft功能区，这一步在病毒骨架质粒上携带了一种卡那霉素抗性，在筛选标记的两端带有一对loxp序列-lox2272(seq id no.9)。有关卡那霉素抗性基因完整序列如seq id no.11所示。

49、第二步利用表达cre重组酶的大肠杆菌进行cre-loxp同源重组，将添加的筛选标记卡那霉素抗性基因给敲除下来，仅保留一段lox2272序列。所构建的fiber嵌合体的病毒骨架简称为ad5f35型。

50、(2)在骨架缺失e3区插入hgm-csf是通过paci酶切fiber嵌合体构建成功的载体ad5f35，在大肠杆菌bj5183中通过同源重组直接将hgm-csf基因插入骨架载体上的paci酶切位点前。

51、在一些具体实施例中，载体质粒图谱为图2。

52、用五型腺病毒的骨架载体pbhgloxδe1,3cre改构后主要是形成了fiber基因的嵌合体，简称ad5f35；在e3缺失区插入了hgm-csf基因。将该骨架载体最后命名为pbhgloxδe1,3cre-hgm-csf-ad5f35-lox2272。

53、所述的步骤(3)中共转染为转染具有表达功能的细胞，所述的细胞可以根据本领域技术人员的公知常识进行选择，本发明中优选为293细胞。事实上还可以是其他表达细胞的类型，如a549细胞或者稳定表达adp基因的293细胞。

54、又一方面，本发明提供了前述的构建方法构建的多靶点溶瘤腺病毒。

55、又一方面，本发明还提供了前述的多靶点溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。

56、本发明同时保护含前述的多靶点溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物。

57、所述的肿瘤包括但不限于消化系统肿瘤或呼吸系统肿瘤。

58、所述的消化系统肿瘤包括但不限于：食管癌、胰腺癌、肠癌、胃癌、肝癌等。

59、所述的呼吸系统骨肿瘤包括但不限于：肺癌、鼻咽癌、喉癌。

60、优选地，所述的药物用于治疗肠癌或肺癌。

61、进一步优选地，所述肠癌包括但不限于：大肠癌、结直肠癌、十二指肠癌，优选为结直肠癌。

62、所述的肠癌可以是隆起型、溃疡型、浸润型。

63、优选地，所述的药物为靶向药物。

64、所述的药物中还包括其他药学上可接受的载体或赋形剂。

65、本发明的有益效果：

66、1.插入肿瘤特异性htert启动子，缺失e1a上的24bp序列，病毒将在rb蛋白突变的肿瘤细胞中特异性复制，提高了安全性；

67、载体缺失e1b基因上的19kd蛋白，增强溶瘤病毒对凋亡的诱导能力；表达p53和hgm-csf细胞因子，提高溶瘤病毒对机体的免疫调控作用；将5型腺病毒的fiber基因改变为和35型腺病毒fiber嵌合型的病毒，改变了病毒感染肿瘤细胞的途径，通过和cd46的作用增强对car表达阴性肿瘤细胞的感染能力。以上操作起到了增强有效性的效果。

68、2.本发明制备的溶瘤腺病毒对肿瘤细胞有很好的杀伤抑制作用，优于现有技术，且对正常细胞安全性高。

69、3.本发明的溶瘤腺病毒能够在肿瘤模型小鼠体内有效的抑制肿瘤的生长，有很好的临床应用前景。