一种Nectin-4单克隆抗体及其CAR-NK细胞的制作方法

本发明抗体及car细胞，更具体地，涉及一种nectin-4单克隆抗体及其car-nk细胞。

背景技术：

1、nectin-4是一种i型膜蛋白，在多种肿瘤细胞中过度表达，并与癌症的形成相关。比如，nectin-4在尿路上皮癌、膀胱癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、食管癌、乳头状甲状腺癌、胆囊癌等癌症中均高表达。nectin-4通过激活pi3k/akt途径促进肿瘤细胞增殖、分化、迁移、侵袭等。因此，nectin-4是一个新的肿瘤免疫治疗靶点。

2、nectin-4不仅可作为乳腺癌的有效预后因子，同时可作为三阴性乳腺癌(tnbc)患者的有效治疗靶点。tnbc患者与其他类型乳腺癌相比具有更差的预后。目前仍缺少有效的生物靶向治疗靶点，主要的治疗方法仍为全身化疗。体内外研究证实，padcev对局部、转移性tnbc具有较好疗效(ann oncol.2017年4月1日线上版)。该研究分析了5673例浸润性乳腺患者中nectin-4/pvrl4 mrna的表达情况，并寻找其与临床病理特征的关系，包括无转移生存。利用免疫组化方法检测61例tnbc患者和原发性tnbc患者源性异种移植(pdx)样本组织。体内外研究检测抗nectin-4在局部、转移性tnbc pdx中的疗效。结果显示，nectin-4mrna高表达与预后差相关，包括三阴性亚型和基底亚型。nectin-4蛋白在健康成人组织中(包括乳腺组织中)无表达。padcev能作用于nectin-4阳性表达的乳腺癌细胞。体外研究显示，padcev与nectin-4具有高度的亲和性，能进行特异性结合，padcev对nectin-4阳性表达细胞系呈剂量依懒性，剂量越高，细胞毒作用越大。体内研究发现，padcev对nectin-4阳性的pdx tnbc具有快速、完全、持久的反应。治疗有效性依赖于padcev剂量及nectin-4在肿瘤中的表达水平。

3、近年来，一种新的肿瘤免疫治疗方法——嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，car)修饰的t/nk细胞(car-t/nk)治疗受到了广泛的关注。car的结构主要包括抗原结合区、跨膜区、胞内信号活化区三大基本构造，是将细胞外抗原结合域与一个或多个细胞内免疫细胞活化信号域结合的基因工程融合蛋白。nk细胞是重要的固有免疫细胞，在抗肿瘤和抗感染中领域扮演着极其重要的角色，因此，car-t技术的发展自然也催生了car-nk的诞生。经过car结构修饰后的nk细胞，理论上也能够高效的识别肿瘤细胞，并通过释放杀伤介质、诱导靶细胞凋亡等多种手段杀伤肿瘤细胞。相较于car-t，由于nk细胞的天然特性，car-nk的治疗过程中不会产生严重的细胞因子风暴，因此在临床使用中，安全性比car-t更高。

4、与car-t构建过程类似，car-nk细胞的构建也是利用基因转染技术(如慢病毒或逆转录病毒载体)对nk细胞重新编程，使其表达car，从而通过一种不依赖主要组织相容性复合物(mhc-i)的机制，重新定向其特异性，靶向特定的肿瘤抗原，增强nk细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。car-nk选择何种肿瘤抗原作为其靶向识别的位点是本技术的关键。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中靶向nectin-4的抗体及car-nk细胞种类较少且治疗效果不佳的技术缺陷，提供一种靶向nectin-4的单克隆抗体以及具有趋化和活化功能的靶向nectin-4的car-nk细胞及其应用。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一个方面，提供一种抗nectin-4的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链；所述重链的重链可变区中具有3个互补区h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3，所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3，其中h-cdr1、h-cdr2、h-cdr3及l-cdr1、l-cdr2、l-cdr3的组合为以下(ⅰ)至(ⅲ)中的任意一种：

4、(ⅰ)h-cdr1的氨基酸序列为vtvnsnp(seq id no.13)，

5、h-cdr2的氨基酸序列为irtgrsa(seq id no.14)，

6、h-cdr3的氨基酸序列为trgvypssy(seq id no.15)，

7、l-cdr1的氨基酸序列为kgvitr(seq id no.16)，

8、l-cdr2的氨基酸序列为ppsyr，(seq id no.17)

9、l-cdr3的氨基酸序列为qkyhsnplt(seq id no.18)；

10、(ⅱ)h-cdr1的氨基酸序列为ftfnsya(seq id no.19)，

11、h-cdr2的氨基酸序列为istggpt(seq id no.20)，

12、h-cdr3的氨基酸序列为arglyytdy(seq id no.21)，

13、l-cdr1的氨基酸序列为qsvfts(seq id no.22)，

14、l-cdr2的氨基酸序列为sasyr，(seq id no.23)

15、l-cdr3的氨基酸序列为qqydsypft(seq id no.24)；

16、(ⅲ)h-cdr1的氨基酸序列为fklttyg(seq id no.25)，

17、h-cdr2的氨基酸序列为kwggdat(seq id no.26)，

18、h-cdr3的氨基酸序列为arkffwyfv(seq id no.27)，

19、l-cdr1的氨基酸序列为qavrtn(seq id no.28)，

20、l-cdr2的氨基酸序列为sgsyr，(seq id no.29)

21、l-cdr3的氨基酸序列为qqknsgpst(seq id no.30)。

22、进一步地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区氨基酸序列为以下(ⅰ)至(ⅲ)中的任意一种：

23、(ⅰ)轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示；

24、(ⅱ)轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示；

25、(ⅲ)轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.6所示。

26、进一步地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列为以下(ⅰ)至(ⅲ)中的任意一种：

27、(ⅰ)重链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示；

28、(ⅱ)重链可变区的氨基酸序列如seq id no.10所示；

29、(ⅲ)重链可变区的氨基酸序列如seq id no.12所示。

30、本发明的第二个方面，提供编码本发明第一个方面所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

31、进一步地，编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子的序列如seq id no.1所示；

32、编码seq id no.4所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.3所示；

33、编码seq id no.6所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.5所示；

34、编码seq id no.8所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.7所示；

35、编码seq id no.10所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.9所示；

36、编码seq id no.12所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.11所示。

37、本发明的第三个方面，提供编码本发明第一个方面所述单克隆抗体或其抗原结合片段的所述轻链可变区；

38、所述重链可变区；

39、所述轻链可变区互补区；或，

40、所述重链可变区互补区的核酸分子。

41、进一步地，编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子的序列如seq id no.1所示；

42、编码seq id no.4所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.3所示；

43、编码seq id no.6所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.5所示；

44、编码seq id no.8所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.7所示；

45、编码seq id no.10所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.9所示；

46、编码seq id no.12所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.11所示。

47、本发明的第四个方面，提供一种表达载体，所述载体中插入有本发明第二个方面或第三个方面所述的核酸分子。

48、本发明的第五个方面，提供一种细胞，含有本发明第二个方面或第三个方面所述的核酸分子或本发明第四个方面所述的表达载体。

49、本发明的第六个方面，提供一种嵌合抗原受体多肽，包含：

50、ⅰ.胞外抗原结合域，所述胞外抗原结合域包含本发明第一个方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，

51、ⅱ.跨膜结构域，和

52、ⅲ.胞内信号域。

53、本发明的第七个方面，提供编码本发明第六个方面所述嵌合抗原受体多肽的核酸分子。

54、进一步地，编码seq id no.4所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq idno.3所示；

55、编码seq id no.6所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.5所示；

56、编码seq id no.8所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.7所示；

57、编码seq id no.10所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.9所示；

58、编码seq id no.12所示氨基酸序列的核酸分子的序列优选如seq id no.11所示。

59、本发明的第八个方面，提供一种遗传修饰的nk细胞，包含本发明第六个方面所述的嵌合抗原受体多肽或本发明第七个方面所述的核酸分子。

60、进一步地，根据本发明第八个方面所述的遗传修饰的nk细胞，通过将含有本发明第七个方面核酸分子的表达载体转染nk细胞制得。

61、优选地，根据本发明第八个方面所述的遗传修饰的nk细胞，所述遗传修饰的nk细胞还包含ccr7的表达序列；

62、更优选地，根据本发明第八个方面所述的遗传修饰的nk细胞，所述遗传修饰的nk细胞还包含il-15的表达序列。

63、具体地，根据本发明第八个方面所述的遗传修饰的nk细胞，所述ccr7的表达序列与il-15的表达序列插入于同一表达载体。

64、更具体地，所述ccr7的表达序列与il-15的表达序列之间优选连接有ires元件。

65、将含有本发明第七个方面所述核酸分子的表达载体与含有ccr7和il-15表达序列的表达载体共同转染nk细胞，即可制得具有趋化及活化功能的car-nk细胞；该car-nk细胞细胞相比仅包含本发明第六个方面所述嵌合抗原受体多肽的car-nk细胞具有更好的抗癌作用。

66、本发明的第九个方面，提供一种制剂，包含以下ⅰ～ⅶ中的至少一项：

67、ⅰ.本发明第一个方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；

68、ⅱ.本发明第二或第三个方面所述的核酸分子；

69、ⅲ.本发明第四个方面所述的表达载体；

70、ⅳ.本发明第五个方面所述的细胞；

71、ⅴ.本发明第六个方面所述的嵌合抗原受体多肽；

72、ⅵ.本发明第七个方面所述的核酸分子；

73、ⅶ.本发明第八个方面所述的遗传修饰的nk细胞。

74、进一步地，所述制剂为生物材料或药物。

75、更进一步地，所述药物中还含有药学上可接受的辅料。

76、本发明的第十个方面，提供以下ⅰ～ⅶ中的至少一项在制备抗肿瘤药物中的应用：

77、ⅰ.本发明第一个方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；

78、ⅱ.本发明第二或第三个方面所述的核酸分子；

79、ⅲ.本发明第四个方面所述的表达载体；

80、ⅳ.本发明第五个方面所述的细胞；

81、ⅴ.本发明第六个方面所述的嵌合抗原受体多肽；

82、ⅵ.本发明第七个方面所述的核酸分子；

83、ⅶ.本发明第八个方面所述的遗传修饰的nk细胞。

84、进一步地，根据本发明第十个方面所述的应用，所述肿瘤包括尿路上皮癌、膀胱癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、食管癌、乳头状甲状腺癌、胆囊癌。

85、本发明的有益效果是：

86、本发明提供了三种nectin-4的单克隆抗体，单克隆抗体培养上清的elisa检测结果为n4c1 od值2.099，n4c2 od值0.919，n4c3 od值1.856，阳性对照(anti-nectin-4antibody，ab155692)od值1.048，阴性对照od值0.104。

87、本发明还提供了编码上述三种nectin-4单克隆抗体包括高变区在内的氨基酸序列及其核酸序列，可用于制备nectin-4单克隆抗体，进行人源化改造，或进一步制备靶向nectin-4与nk细胞的双特异性抗体，或car-nk细胞，具有开发抗肿瘤新药的潜力。

88、本发明提供了一种嵌合抗原受体多肽，包含：胞外抗原结合域，跨膜结构域和胞内信号域，其中胞外抗原结合域包含与上述nectin-4蛋白结合的单克隆抗体或抗体片段。

89、本发明还提供了一种靶向nectin-4的car-nk细胞，通过将靶向nectin-4的car基因表达载体与ccr7-ires-il15基因表达载体共同导入nk细胞制得715n4car-nk细胞，与仅有靶向性的n4car-nk细胞或仅有淋巴趋化和免疫细胞活化功能的715nk细胞相比，715n4car-nk细胞同时具有趋化、活化及靶向三重功能，具有更全面的抗三阴乳腺癌活性。715n4car-nk细胞具有开发抗肿瘤新药的潜力。