一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用。

背景技术：

1、甘油磷酸氧化酶(g3po，ec 1.1.3.21)是用耦联酶法测定甘油三酯含量的关键酶之一，目前，以其特有的高特异性和高灵敏度被广泛地应用于心脏病和高血脂的临床判断中。

2、对甘油磷酸氧化酶的研究始于二十世纪三十年代，主要研究对象是streptococcus faecalis来源的蛋白。目前已有的商品化甘油磷酸氧化酶往往来自于多步的分离纯化产物，主要生产国包括日本、美国和英国等。中国对甘油磷酸氧化酶的研究起步较晚，相关的报道并不是特别多，大部分用于临床诊断的甘油磷酸氧化酶仍需要进口。同时，随着人们生活水平的日益提高，工作压力日益增强，重视健康的理念逐渐被人们作为衡量生活品质高低的标准之一，因此，中国国内对甘油磷酸氧化酶的需求也呈现上升趋势。

3、目前关于甘油磷酸氧化酶的研究主要集中于pediococcus acidilactici，aerococcus viridans，streptococcus faecalis和enterococcus sp.等来源。专利文献cn110938607a报道了一种来源于pediococcus acidilactici的甘油磷酸氧化酶，还进行了随机突变，提高了热稳定性[1]。王腾等报道了一种采用诱导培养基链球菌制备磷酸甘油氧化酶的方法，以streptococcus faecalis来源的g3po基因进行重组表达，以聚乙二醇-硫酸铵双水相萃取和两步层析纯化得到g3po目的蛋白[2]。四川大学于彩霞从23株菌种中筛选出了enterococcus sp.来源的甘油磷酸氧化酶，利用多步纯化硫酸铵分级沉淀、dade-sepharose ff离子交换层析、phenyl sepharose cl-4b疏水层析、chelating sepharoseff亲和层析和sephacryls-200hr处理，操作较为复杂[3]。另外，随着人们生活品质的日渐提升，健康问题受到越来越多的重视，血清甘油三酯含量的检测受到越来越多的关注。检测血清甘油三酯含量的试剂涉及一个重要的酶——甘油磷酸氧化酶，因此该酶具有较好的市场前景。

4、血清甘油三酯含量检测已经由此前的化学法基本完全转化为目前的酶法。酶法检测甘油三酯快速方便，准确率高，且可以应用在生化分析仪上，还可进行大批量检测。酶法检测的检测原理如下：待检测样品在脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase)的作用下水解生成甘油(glycerol)和脂肪酸(fatty acid)，甘油和atp在甘油激酶(glycerol kinase)作用下生成甘油-3-磷酸(glycerol-3-p)，甘油-3-磷酸在甘油磷酸氧化酶(l-α-glycerophosphate oxidase)作用下生成磷酸二羟基丙酮(dihydroxyacetone-p)和双氧水(h2o2)，双氧水可以在4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，4-aa)、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠(toos)以及辣根过氧化物酶(peroxidase)作用下生成显色物质醌亚胺(quinoneimine dye)，根据醌亚胺在可见光下的吸收变化可以反应出甘油三酯的含量，达到检测的目的。具体的反应原理如下所示：

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9、此前大部分甘油磷酸氧化酶是利用天然微生物发酵培养获得，产量低、纯化难度高，限制了酶法检测tg试剂的研发和普及，同时甘油磷酸氧化酶的稳定性也会大大影响试剂的检测准确性。

10、目前，绿色气球菌来源的甘油磷酸氧化酶(g3po)野生型稳定性有所欠缺，有待开发一种稳定性提高的甘油磷酸氧化酶突变体，从而提高其应用稳定性。

11、[1]邹炳德,邹继华,章玉胜,汪屹,张帅,张永.热稳定性好的甘油-3-磷酸氧化酶及其在试剂盒中的应用,cn 110938607 a.

12、[2]王腾,孟延发.用诱导培养基链球菌制备磷酸甘油氧化酶的方法,cn101070529 a.

13、[3]高国生,董飞波,孙毅,华馨,张文宇,杨锦勋.一种重组甘油磷酸氧化酶表达载体及其建立方法,cn 110184289 a.

技术实现思路

1、鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题之一是如何开发一种稳定性提高的甘油磷酸氧化酶(g3po)突变体，从而提高其应用稳定性。

2、本发明第一方面提供了一种甘油磷酸氧化酶突变体(g3po突变体)，所述甘油磷酸氧化酶突变体基于野生型甘油磷酸氧化酶的氨基酸序列进行定点突变，所述野生型甘油磷酸氧化酶(野生型g3po)的氨基酸序列如seq id no.:4所示，突变方式选自：d102n、t90v、a363s、f555e、f6l、g29p、g399k、g399e、a376k、g399p、h92q、a341t、e204d、v209n、s218t、l131v、v198a、t221s、h227r、v228r、e392k、t370s、i179s、s501a、k113g、q474f、v492t、s82a、q464n及包括前述突变方式的组合突变方式。

3、在本发明的一些较佳实施方式中，所述组合突变方式选自d102n、t90v、a363s、f555e、f6l、g29p、g399k、g399e、a376k、g399p、h92q、a341t、e204d、v209n、s218t、l131v、v198a、t221s、h227r、v228r、e392k、t370s、i179s、s501a、k113g、q474f、v492t、s82a、q464n中至少两种突变方式组合而成的组合突变方式。

4、在本发明的一些较佳实施方式中，所述突变方式选自：d102n、t90v、a363s、f555e及包括前述突变方式的组合突变方式。

5、在本发明的一些较佳实施方式中，所述组合突变方式选自以下任一种组合突变方式：

6、l4f+e574k，d102n+t90v+e574k，t370s+f555e+e574k等；

7、d102n+t90v+a363s+q464n+f555e+e574k，

8、t90v+a363s+f555e+i179s+v198a，

9、d102n+t90v+q464n+v492t+f555e+e574k，

10、d102n+t90v+a363s+f555e+f6l，

11、d102n+t90v+a376k+g399k+s501a+f555e，d102n+t90v+e574k，

12、d102n+t90v+a341t+t370s+q474f+e574k，d102n+t90v+a363s+f555e，

13、f6l+g29p+a341t+a363s+f555e+e574k等；

14、d102n+t90v+g399k+s501a+q464n，t90v+l131v+a341t+q464n，

15、t90v+f555e+a376k+g399e+q474f，k113g+i179s+s218t+q474f+v492t，

16、v198a+e204d+q464n+s501a，t90v+a363s+q464n，

17、t90v+a363s+q474f+f555e，s82a+a363s+a341t+t370s+q464n，

18、s82a+q464n，d102n+t90v+q464n等。

19、本发明第二方面提供了一种甘油磷酸氧化酶突变体的融合蛋白，所述甘油磷酸氧化酶突变体的融合蛋白在第一方面所述甘油磷酸氧化酶突变体的n端和/或c端连接有融合标签。

20、在本发明的一些较佳实施方式中，所述融合标签包括亲和标签。

21、在本发明的一些较佳实施方式中，所述亲和标签选自：his-tag、gst、flag-tag、mbp及其组合。

22、本发明第三方面提供了一种核酸构建物，其核苷酸序列选自下述任一种：

23、(i)编码第一方面所述甘油磷酸氧化酶突变体或者第二方面所述融合蛋白的核苷酸序列；和

24、(ii)与(i)中所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。

25、所述核酸构建物可以为dna、mrna或者其组合。

26、本发明第四方面提供了一种重组载体，所述重组载体含有第三方面所述核酸构建物。

27、在本发明的一些较佳实施方式中，所述重组载体为含有第三方面所述核酸构建物的表达质粒。

28、在本发明的一些较佳实施方式中，所述重组载体的类型选自：pet 28a，pet 30a，pany1，pqe30，pg-kje8，pgro7，pkje7，pg-tf2，ptf16，puc18，puc19和pgex。

29、本发明第五方面提供了一种工程菌，所述工程菌的基因组整合有第三方面所述核酸构建物，或者所述工程菌含有第四方面所述重组载体。

30、在本发明的一些较佳实施方式中，所述工程菌来源于大肠杆菌。

31、本发明第六方面提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞的基因组整合有第三方面所述核酸构建物，或者所述基因工程细胞含有第四方面所述重组载体。

32、在本发明的一些较佳实施方式中，所述基因工程细胞来源于大肠杆菌。

33、本发明第七方面提供了一种从突变文库中筛选甘油磷酸氧化酶突变体的方法，包括以下步骤：

34、(1)构建如seq id no.:4所示的野生型g3po的突变文库，突变位点包括：4、6、29、55、78、82、90、92、100、102、113、119、123、127、131、147、179、196、198、204、209、218、221、227、228、261、269、341、363、370、376、392、399、452、460、463、464、466、470、474、492、501、531、547、555、560、572、574和584，得到由g3po突变体组成的突变文库；突变方式包括单点突变方式及组合突变方式；

35、(2)以野生型g3po的基因为模板，得到所述突变文库中各g3po突变体的编码序列；

36、(3)对所述突变文库中各g3po突变体分别构建重组载体(如第四方面所述重组载体)，转化到宿主菌中得到重组表达菌株，诱导所述重组表达菌株，表达得到所述突变文库的g3po突变体或其融合蛋白(对应第一方面所述g3po突变体或第二方面所述融合蛋白)；当所述重组载体中的g3po突变体的编码序列连接有融合标签(如亲和标签)时，表达得到所述突变文库的g3po突变体的融合蛋白；

37、(4)对所述g3po突变体或其融合蛋白进行蛋白比活力和稳定性分析，筛选得到第一方面所述g3po突变体或者第二方面所述融合蛋白。

38、本发明第八方面提供了一种甘油磷酸氧化酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

39、(1)将第三方面所述核酸构建物克隆到表达载体上，得到含有所述g3po突变体或其融合蛋白的编码序列的重组载体；

40、(2)将所述重组载体转化到宿主菌中，得到含有所述g3po突变体或其融合蛋的编码序列的重组表达菌株；

41、(3)诱导所述重组表达菌株，在适宜表达条件下表达得到所述g3po突变体或其融合蛋(对应第一方面所述g3po突变体或第二方面所述融合蛋白)。

42、在本发明的一些较佳实施方式中，所述重组表达菌株为大肠杆菌，此时，所述适宜表达条件包括：0.1mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，0.1wt％的诱导前体物质，25℃诱导16小时。所述诱导前体物质可以为黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)、核酸素、核黄素类似物或者其组合。

43、本发明第九方面提供了第一方面所述甘油磷酸氧化酶突变体、第二方面所述融合蛋白、第三方面所述核酸构建物、第四方面所述重组载体、第五方面所述工程菌以及第六方面所述基因工程细胞在血清甘油三酯含量检测方面的应用。

44、本发明公开的技术方案所带来的有益效果包括：

45、1、本发明构建了野生型甘油磷酸氧化酶的稳定性突变文库，将g3po突变体基因克隆到表达载体上，然后转化到宿主菌中构建成相应的单位点突变菌株，经诱导表达后，对表达产物进行稳定性分析，筛选得到了20多种热稳定性明显提升的g3po突变体(包括但不限于d102n、t90v、a363s和f555e四种单点突变体)，还筛选得到了40多种包含前述单点突变的较佳的组合突变体(如d102n、t90v、a363s、q464n、f555e和e574k的六点组合突变)，均可用于催化甘油-3-磷酸反应生成磷酸二羟基丙酮。

46、2、本发明公开了20多种热稳定性至少提高40％以上的g3po单点突变体，活力的定量分析依据蛋白比活力或者46℃孵育20min残余活力百分数。其中，f6l、g29p和g399k突变体的蛋白比活力相对于野生型g3po略有提升，且热稳定性提高了0.5～1.6倍；d102n、t90v、a363s、f555e突变体的蛋白比活力能达到野生型g3po的90％以上，且热稳定性提高了2倍以上；g399e、a376k、g399p、h92q、a341t、e204d和v209n突变体的蛋白比活力能达到野生型g3po的90％以上，且热稳定性提高了0.8～2.4倍；s501a、k113g、q474f、v492t、s82a和q464n突变体的热稳定性相对于野生型g3po提高了1.5～3.1倍，同时蛋白比活力达到野生型g3po的21％～60％。

47、3、综合考虑g3po突变体的活力和稳定性，本发明获得了综合性能显著提升的单点突变方式的g3po突变体，包括d102n、t90v、a363s和f555e单点突变方式的g3po突变体。

48、4、本发明还公开了保持一定活力基础上稳定性显著提升的、由以下单点突变方式组合而成的组合突变体：l4f、e574k、d102n、t90v、e574k、t370s、f555e、a363s、v492t、g399p、e204d、a376a、g29p等。

49、5、此外本发明具体公开了40多种热稳定性至少提高60％以上的组合突变方式的g3po突变体，活力的定量分析依据蛋白比活力或者48℃孵育20min残余活力百分数。其中，l4f+e574k，d102n+t90v+e574k和t370s+f555e+e574k蛋白比活力提升10％以上，稳定性提高80％以上；d102n+t90v+a363s+q464n+f555e+e574k，t90v+a363s+f555e+i179s+v198a，d102n+t90v+q464n+v492t+f555e+e574k，d102n+t90v+a363s+f555e+f6l，d102n+t90v+a376k+g399k+s501a+f555e，d102n+t90v+e574k，d102n+t90v+a341t+t370s+q474f+e574k，d102n+t90v+a363s+f555e，f6l+g29p+a341t+a363s+f555e+e574k等突变体稳定性提高400％以上同时蛋白比活力基本维持不降；d102n+t90v+g399k+s501a+q464n，t90v+l131v+a341t+q464n，t90v+f555e+a376k+g399e+q474f，k113g+i179s+s218t+q474f+v492t，v198a+e204d+q464n+s501a，t90v+a363s+q464n，t90v+a363s+q474f+f555e，s82a+a363s+a341t+t370s+q464n，s82a+q464n，d102n+t90v+q464n等突变体稳定性提升400％以上，蛋白比活力下降至野生型的30％-80％。

50、6、综合考虑g3po突变体的活力和稳定性，本发明获得了综合性能提升极为显著的组合突变体，包括d102n+t90v+a363s+q464n+f555e+e574k g3po六点组合突变体，其蛋白比活力提高至野生型g3po的109.3％，48℃半衰期提升至野生型g3po的822.9％(也即提高了7倍以上)。

51、7、本发明还提供了一种在大肠杆菌细胞中重组异源表达的甘油磷酸氧化酶及其突变体的批量制备方法及纯化方法，还结合稳定性突变文库筛选出热稳定性较好的g3po突变体，特别是热稳定性好、酶活力高的g3po突变体。

52、以上优点使得本发明的甘油磷酸氧化酶突变体在血清甘油三酯含量检测方面极具应用潜力。

53、以下将结合附图对本发明的构思、具体技术方案及产生的技术效果作进一步说明，以便充分地了解本发明的目的、特征和效果。