催化粘康酸生成己二酸的烯酸还原酶的突变体蛋白及应用

本发明属于酶的理性设计改造和生物催化应用，涉及一种催化粘康酸生成己二酸的烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用。

背景技术：

1、己二酸含有6个碳的二元羧酸，广泛应用于生产尼龙6.6、工程塑料和可降解塑料pbat等。截止至2020年12月底，全球己二酸总产能约490.8万吨左右。目前生产己二酸普遍还是通过石油化工路线，在合成过程中会产生大量的n2o，如硝酸催化ka油(环己醇/环己酮混合物)的氧化进行化学合成，其造成的温室气候影响比co2高298倍。而使用绿色可再生原料生产可以生物己二酸有效地降低其带来的环境污染。

2、目前生物法合成己二酸途径主要有：i)全生物合成：已经证明可行的方法有反向己二酸降解途径、β-氧化或逆β-氧化与ω-氧化途径结合、2-氧代庚二酸途径；ii)生物合成己二酸前体并化学转化：研究较多是先将可再生生物质转化为顺式，顺式-粘康酸或葡萄糖酸，之后通过化学法生成己二酸。1994年，弗罗斯特等人首次报道以葡萄糖为碳源合成粘康酸的半生物合成方法，在摇瓶和生物反应器中分别产生约2.4g/l和38.6g/l的粘康酸。已有研究报道了5种来源的烯醇还原酶(ers)在大肠杆菌中表达后具有催化粘康酸(顺式，顺式)到己二酸的活性，其中来自凝结芽孢杆菌的烯醇还原酶(enoate reductases fromb.coagulans)具有最高的活性，在0.7mm粘康酸(顺式，顺式)添加下进行的全细胞生物转化实验显示，培养24h后转化率为94.3％，然而其活性仍处于较低水平。最近孙婧等人通过构建基于工程大肠杆菌的共培养系统，以葡萄糖为碳源并在微需氧条件下，在72小时内己二酸产量达到27.6±1.3mg/l(0.005g/g碳源)。如此看来通过粘康酸合成己二酸途径生产生物己二酸成为了可能，但该代谢通路中转化粘康酸至己二酸的关键酶活性较低的问题成为了限制该途径的重要因素。因此需要针对该反应研究开发一种高催化活性的烯酸还原酶。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有的烯酸还原酶酶在以粘康酸为底物的条件下酶活较低的问题，提供一种催化粘康酸生成己二酸的烯酸还原酶的突变体蛋白，该突变体蛋白具有较高的酶活力，可实现对于粘康酸到己二酸的高效转化。

2、为此，本发明第一方面提供了一种影响烯酸还原酶催化粘康酸生成己二酸的酶活力的氨基酸突变子，其包括位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列n端到c端的第27位gly突变成met、第287位his突变成ile、第287位his突变成met、第287位his突变成val、第371位met突变成his、第371位met突变成asn、第371位met突变成ser、第374位ile突变成ser、第374位ile突变成thr的突变中的一个或几个。

3、本发明第二方面提供了一种催化粘康酸生成己二酸的烯酸还原酶的突变体蛋白，其序列包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第27位gly突变成met、第287位his突变成ile、第287位his突变成met、第287位his突变成val、第371位met突变成his、第371位met突变成asn、第371位met突变成ser、第374位ile突变成ser、第374位ile突变成thr的突变中的一个或几个。

4、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为1号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第27位gly突变成met的突变，本发明中简称为蛋白erbc突变体g27m。

5、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述1号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.2所示。

6、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为2号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第287位his突变成ile的突变，本发明中简称为erbc突变体h287i。

7、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述2号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.3所示。

8、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为3号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第371位met突变成asn的突变，本发明中简称为erbc突变体m371n。

9、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述3号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.4所示。

10、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为4号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第371位met突变成，本发明中简称为erbc突变体m371h。

11、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述4号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.5所示。

12、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为5号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第374位ile突变成ser的突变，本发明中简称为erbc突变体i374s。

13、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述5号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.6所示。

14、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为6号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第374位ile突变成thr的突变，本发明中简称为erbc突变体i374t。

15、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述6号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.7所示。

16、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为7号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第27位gly突变成met，第374位ile突变成thr的突变，本发明中简称为erbc突变体g27m/i374t。

17、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述7号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.8所示。

18、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为8号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第27位gly突变成met，第374位ile突变成ser的突变，本发明中简称为erbc突变体g27m/i374s。

19、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述8号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.9所示。

20、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为9号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第371位met突变成asn，第374位ile突变成thr的突变，本发明中简称为erbc突变体m371n/i374t。

21、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述9号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.10所示。

22、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为10号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第371位met突变成his，第374位ile突变成ser的突变，本发明中简称为erbc突变体m371h/i374s。

23、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述10号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.11所示。

24、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为11号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第287位his突变成ile，第374位ile突变成ser的突变，本发明中简称为erbc突变体h287i/i374s。

25、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述11号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.12所示。

26、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为12号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第27位gly突变成met，第287位his突变成met，第374位ile突变成thr的突变，本发明中简称为erbc突变体g27m/h287m/i374t。

27、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述12号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.13所示。

28、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为13号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第27位gly突变成met，第371位met突变成ser，第374位ile突变成thr的突变，本发明中简称为erbc突变体g27m/m317s/i374t。

29、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述13号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.14所示。

30、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为14号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第27位gly突变成met，第287位his突变成ile，第371位met突变成ser的突变，本发明中简称为erbc突变体g27m/h287i/m371s。

31、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述14号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.15所示。

32、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为15号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第27位gly突变成met，第287位his突变成val，第374位ile突变成ser的突变，本发明中简称为erbc突变体g27m/h287v/i374s。

33、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述15号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如seq id no.16所示。

34、根据本发明，所述突变体蛋白还包括上述烯酸还原酶突变体蛋白的n端或c端连接标签得到的融合蛋白；优选地，所述标签包括his标签和/或sumo标签；进一步优选地，所述突变体蛋白还包括由1号烯酸还原酶突变体蛋白、2号烯酸还原酶突变体蛋白、3号烯酸还原酶突变体蛋白、4号烯酸还原酶突变体蛋白、5号烯酸还原酶突变体蛋白、6号烯酸还原酶突变体蛋白、7号烯酸还原酶突变体蛋白、8号烯酸还原酶突变体蛋白、9号烯酸还原酶突变体蛋白、10号烯酸还原酶突变体蛋白、11号烯酸还原酶突变体蛋白、12号烯酸还原酶突变体蛋白、13号烯酸还原酶突变体蛋白、14号烯酸还原酶突变体蛋白或15号烯酸还原酶突变体蛋白的n端或c端连接his标签或sumo标签得到的融合蛋白。

35、本发明第三方面提供了一种影响烯酸还原酶催化粘康酸生成己二酸的酶活力的核苷酸突变子，其包括位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所示的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第67位a突变为g、第68位t突变为g、第69位g突变为c、第79位g突变为a、第80位g突变为t、第81位c突变为g、第859位c突变为a或g，第860位a突变为t、第861位c突变为t或g、第1111位a突变为c、第1112位t突变为a或g、第1113位g突变为c、第1121位t突变为c或g的突变中的一个或几个。

36、本发明第四方面提供了一种编码本发明第二方面所述的突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seqid no.17所示的核苷酸序列中的从5′端到3′端方向的第67位a突变为g、第68位t突变为g、第69位g突变为c、第79位g突变为a、第80位g突变为t、第81位c突变为g、第859位c突变为a或g，第860位a突变为t、第861位c突变为t或g、第1111位a突变为c、第1112位t突变为a或g、第1113位g突变为c、第1121位t突变为c或g的突变中的一个或几个。

37、本发明中，所述野生型erbc由野生凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans 36d1)产生；如seq id no.1所示的氨基酸序列为野生凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans 36d1)烯酸还原酶的氨基酸序列；编码野生型erbc的如seq id no 1所示的氨基酸序列的如seq idno.17所述的核苷酸序列为野生凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans 36d1)烯酸还原酶基因(其genbank登录号cp003056.1)的核苷酸序列。

38、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码1号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第67位a突变为g、第68位t突变为g、第69位g突变为c的突变。

39、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.18所示。

40、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码2号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第859位c突变为a，第860位a突变为t、第861位c突变为t、第1121位t突变为c的突变。

41、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.19所示。

42、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码3号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第1112位t突变为a或g、第1113位g突变为c的突变。

43、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.20所示。

44、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码4号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第1111位a突变为c、第1112位t突变为a、第1113位g突变为c的突变。

45、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.21所示。

46、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码5号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第1121位t突变为g的突变。

47、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.22所示。

48、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码6号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第1121位t突变为c的突变。

49、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.23所示。

50、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码7号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第79位g突变为a、第80位g突变为t、第81位c突变为g、第1121位t突变为c的突变。

51、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.24所示。

52、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码8号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第79位g突变为a、第80位g突变为t、第81位c突变为g、第1121位t突变为g的突变的突变。

53、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.25所示。

54、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码9号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第1112位t突变为a、第1113位g突变为c、第1121位t突变为c的突变。

55、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.26所示。

56、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码10号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第1111位a突变为c、第1112位t突变为a、第1113位g突变为c、第1121位t突变为g的突变。

57、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.27所示。

58、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码11号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第859位c突变为a，第860位a突变为t、第861位c突变为t、第1112位t突变为g、第1113位g突变为c。

59、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.28所示。

60、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码12号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第859位c突变为a，第860位a突变为t、第861位c突变为g、第1121位t突变为c的突变。

61、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.29所示。

62、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码13号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第79位g突变为a、第80位g突变为t、第81位c突变为g、第1112位t突变为g、第1113位g突变为c、第1121位t突变为c突变。

63、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.30所示。

64、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码14号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第79位g突变为a、第80位g突变为t、第81位c突变为g、第859位c突变为a，第860位a突变为t、第861位c突变为t、第1112位t突变为g、第1113位g突变为c的突变。

65、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.31所示。

66、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码15号烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生烯酸还原酶的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.17所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第79位g突变为a、第80位g突变为t、第81位c突变为g、第859位c突变为g，第860位a突变为t、第861位c突变为g、第1121位t突变为g的突变。

67、在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码烯酸还原酶突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.32所示。

68、根据本发明，所述核苷酸分子为如下dna分子：

69、(a1)编码区包括如seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20、seq id no.21、seq id no.22、seq id no.23、seq id no.24、seq id no.25、seq idno.26、seq id no.27、seq id no.28、seq id no.29、seq id no.30、seq id no.31、seq idno.32所示的核苷酸序列的dna分子；

70、(a2)核苷酸序列如seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20、seq id no.21、seq id no.22、seq id no.23、seq id no.24、seq id no.25、seq idno.26、seq id no.27、seq id no.28、seq id no.29、seq id no.30、seq id no.31、seq idno.32所示的核苷酸序列的dna分子；

71、(a3)与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码本发明第二方面中所述的蛋白质的dna分子；

72、(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列杂交，且编码本发明第二方面中的所述的蛋白质的dna分子。

73、本发明第五方面提供了一种含有本发明第四方面所述的核苷酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

74、本发明第六方面提供了如本发明第二方面所述的突变体蛋白或由本发明第四方面所述的核苷酸分子或如本发明第五方面所述的表达盒、重组载体或重组微生物制得的突变体蛋白在催化粘康酸生成己二酸中的应用；优选地，所述应用包括催化粘康酸生成己二酸、提高催化合成己二酸产量和提高烯酸还原酶催化效率。

75、在本发明的一些实施例中，所述应用包括催化粘康酸的双键还原、提高己二酸产量和提高烯酸还原酶的催化效率。

76、本发明中，所述粘康酸包括粘康酸(顺式、顺式)、粘康酸(顺式、反式)、粘康酸(反式、反式)；优选为粘康酸(顺式、顺式)。

77、本发明所述用语“erbc”是指烯酸还原酶，“hplc”是指高效液相色谱法。

78、本发明中所述用语“蛋白”与“蛋白质”可以互相使用。

79、本发明中所述用语“比酶活”与“比活力”可以互相使用，指单位质量酶蛋白所具有的酶活。

80、本发明中所述用语“加热”与“热处理”可以互相使用。

81、本发明中所述用语“核苷酸突变子”是指基因的核苷酸系列中可发生突变的最小单位。

82、类似地，本发明中所述用语“氨基酸突变子”是指蛋白质的氨基酸序列中可发生突变的最小单位。

83、本发明中所述用语“变体”与“突变体”可以互相使用。

84、本发明中的检测方法及仪器：

85、(1)采用ptc-200型pcr仪(mjresearch.inc.美国)进行pcr扩增。

86、(2)采用mini-sub cell gt power pac 1000型琼脂糖凝胶电泳仪(美国bio-rad公司)进行pcr产物的检测与分离。

87、(3)采用hplc u3000型高效液相色谱仪(thermo fisher scientific)测定产物。

88、研究结果表明，本发明所提供的催化粘康酸生成己二酸的烯酸还原酶的改造方法通过计算设计和定点突变进行烯酸还原酶的改造，至少可以大幅度提高四种烯酸还原酶的催化粘康酸的双键还原活性，改造后的烯酸还原酶的突变体的酶活力有较大的提升，可实现己二酸的高效生产。