基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪试剂盒及追踪方法与流程

本发明属于鱼类监测追踪，具体涉及基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪试剂盒及追踪方法。

背景技术：

1、长江鲟(acipenser dabryanus dumeril)又名鲟鱼、沙腊子，为淡水定居性鱼类，栖息于长江上游水流较急、石质河底的水流中，与白鲟、中华鲟一起为长江里生活的鲟鱼。相较于其他2种鲟鱼，长江鲟体型较小、体重较轻，但它们面临着同样的困境，种群规模越来越小。2022年7月21日，国际自然与自然资源保护联盟(international union forconservation of nature and natural resources，iucn)发布全球濒危物种红色目录更新报告，宣布白鲟灭绝、长江鲟野外灭绝、中华鲟仍维持“极危”等级。iucn鲟鱼专家组中国唯一成员、中国水产科学研究院首席科学家危起伟表示，比白鲟幸运的是，长江鲟和中华鲟已实现人工保种。为了保护野外长江鲟种群数量，自2018年开始，地方政府、相关研究机构每年都会进行长江鲟野外增殖放流活动，但截至目前长江全江段均未发现自然繁殖的长江鲟幼苗。放流长江鲟能否在长江建立稳定种群、进行自然繁殖是野外长江鲟种群数量恢复的关键。通过调查放流长江鲟的行为轨迹，可帮助我们进一步了解长江鲟在自然水体中的行为趋势，进而为推断长江鲟的偏好栖息地及后期栖息地的修复等恢复长江鲟种群的研究奠定基础。

2、传统的鱼类检测方法为通过下网捕捞鱼体来调查鱼类的分布范围，这类方法虽然直观有效，但是对鱼类群体存在一定的损伤，且费时费力。目前对长江鲟放流标记追踪技术主要有以下几种：pit标记、声呐标记、t型标记。其中通过声呐标记，可以实现对长江鲟在长江活动过程的记录；但是其需要再沿江设置多个声呐信号接收器，成本较高；而pit标记、t型标记以及dna标记需要在鱼体中打上标记，由于标记鱼体占放流鱼体的比例较小，通过追踪标记鱼体来推断整个鱼群的行为轨迹时，经常出现漏测的情况，收集到的可用数据甚少，不利于充分了解放流鱼体的行为、分布偏好等。此外，标记法也会伤害鱼体，声呐装置也会对水生生物的接受和发送信息进行干扰，造成水生生物的活动出现异常，严重时造成死亡。因此有必要开发一种不伤害鱼体、不影响其他水生生物正常生命活动的追踪方法来揭示放流长江鲟的行为轨迹。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明提供基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪试剂盒及追踪方法，通过设置合理的采样点，收集的水体环境中的dna，然后通过设计特异性引物对和taqman荧光探针，对收集的水体环境dna进行浓度检测，实现“非接触式”的对放流长江鲟行为轨迹进行追踪。

2、为了实现上述目的，本发明提供一种基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物对、taqman荧光探针、dna模板、ddpcr预混液和ddh2o。

3、优选的，所述特异性引物对包括上游引物nd5-f4，序列为seq id no:1；下游引物nd5-r4，序列为seq id no:2；taqman荧光探针的序列为seq id no:3。

4、优选的，所述ddpcr预混液包括vials和2×supermix。

5、优选的，所述dna模板为水体样本dna，且该水样中包含的长江鲟dna浓度≥0.05copies/μl。

6、本发明还提供一种基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪方法，包括以下步骤：

7、(1)在研究水域设置采样断面，并在采样断面上设置采样点，于放流前1天及放流后5天时间内，每天在每个采样点采集2l水体；

8、(2)将采集水体在24h内用混合纤维素滤膜真空抽滤，保存抽滤后的混合纤维素滤膜；

9、(3)提取混合纤维素滤膜上的dna，并于-20℃保存备用；

10、(4)以步骤(3)得到的dna作为模板，利用上述追踪试剂盒进行ddpcr检测，确定每个采集水体中目的序列的浓度，从而确定长江鲟的行为轨迹。

11、优选的，步骤(1)所述的采样断面的间隔为2-3km，采样点数量为2-5个。

12、优选的，步骤(2)所述的混合纤维素滤膜的孔径为0.22μm。

13、优选的，步骤(2)所述的保存方法为-20℃保存或常温下保存于longmire’sbuffer中。

14、优选的，步骤(3)所述的dna提取方法为采用water dna kit(omega)试剂盒进行提取。

15、优选的，步骤(4)所述的ddpcr检测的扩增体系为dna模板8.5μl，正反向引物各0.5μl，探针0.5μl，2×ddpcr预混液10μl；扩增程序为95℃预变性10min，94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸30s，40个循环，98℃酶失活10min，4℃保持。

16、本发明的有益效果在于：

17、1、通过对长江鲟及长江流域常见鱼类线粒体dna序列进行分析，设计筛选到了能特异性的检测长江鲟目的dna片段的特异性引物对nd5-f4/nd5-r4和taqman荧光探针nd5probe4，利用该特异性引物对和taqman荧光探针可以特异性的、稳定有效的扩增出长江鲟的目的dna片段。

18、2、筛选得到的特异性引物对nd5-f4/nd5-r4和taqman荧光探针nd5probe4，可以成功检测到养殖水体和放流水体中长江鲟目的dna片段，即使水样中的长江鲟dna浓度较低，只要其浓度≥0.05copies/μl，依然能利用ddpcr技术进行检测，具有较高的灵敏性。

19、3、提供了一种基于探针法对在长江上游人工增殖放流长江鲟的行为轨迹进行追踪的方法，主要是基于筛选得到的特异性引物对nd5-f4/nd5-r4和taqman荧光探针nd5probe4进行水体环境dna浓度的检测，从而确定放流后长江鲟的主要位置以及行为轨迹，相对于传统的捕捞法及常用的声呐监测法，为“非接触式”追踪，对鱼体不会产生伤害且省时省力，同时也不需要大量昂贵的设备，避免了因标记和设备布设数量有限导致的漏测情况，从而无法全面了解目标鱼类的行为轨迹。整体而言，利用本发明的基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪方法，不会对调查水域原有水生生物及目标鱼类造成任何损伤，不仅仅关注于标记鱼体的行为轨迹，更能对整个放流长江鲟群体的行为轨迹进行追踪，研究结果相较于个体标记追踪而言更具代表性。

技术特征：

1.一种基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括特异性引物对、taqman荧光探针、dna模板、ddpcr预混液和ddh2o。

2.根据权利要求1所述的一种基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪试剂盒，其特征在于：所述特异性引物对包括上游引物nd5-f4，序列为seq id no:1；下游引物nd5-r4，序列为seq id no:2；taqman荧光探针的序列为seq id no:3。

3.根据权利要求1所述的一种基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪试剂盒，其特征在于：所述ddpcr预混液包括vials、2×supermix。

4.根据权利要求1所述的一种基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪试剂盒，其特征在于：所述dna模板为水体样本dna，且该水样中包含的长江鲟dna浓度≥0.05copies/μl。

5.一种基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪方法，其特征在于：包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的一种基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪方法，其特征在于：步骤（1）所述的采样断面的间隔为2-3km，采样点数量为2-5个。

7.根据权利要求5所述的一种基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪方法，其特征在于：步骤（2）所述的混合纤维素滤膜的孔径为0.22µm。

8.根据权利要求5所述的一种基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪方法，其特征在于：步骤（2）所述的保存方法为-20℃保存或常温下保存于longmire’s buffer中。

9.根据权利要求5所述的一种基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪方法，其特征在于：步骤（3）所述的dna提取方法为采用e.z.n.a.® water dna kit试剂盒进行提取。

10.根据权利要求5所述的一种基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪方法，其特征在于：步骤（4）所述的ddpcr检测的扩增体系为dna模板8.5 μl，正反向引物各0.5 μl，探针0.5 μl，2×ddpcr预混液10 μl；扩增程序为95℃ 预变性10 min，94℃ 变性30 s，60℃ 退火40 s，72℃延伸30 s，40个循环，98℃ 酶失活10 min，4℃保持。

技术总结
本发明公开了基于探针法的长江上游放流长江鲟行为轨迹追踪试剂盒及追踪方法，通过对长江鲟及长江流域常见鱼类的线粒体DNA序列进行分析，设计并筛选到了能特异性扩增出长江鲟线粒体DNA的特异性引物对ND5‑F4/ND5‑R4以及Taqman荧光探针ND5 Probe4，利用特异性引物和Taqman荧光探针与ddPCR预混液组成试剂盒，对收集得到的放流前后环境DNA样本进行ddPCR检测，可以追踪和监视放流长江鲟的行为轨迹，实现了“非接触”式放流长江鲟行为轨迹追踪，避免了追踪过程中对鱼体的伤害，并且降低了追踪成本，提高了整体追踪的准确性。

技术研发人员：李莎,党莹超,李志远,姜伟,俞兆曦,刘雪清,苏巍
受保护的技术使用者：中国长江三峡集团有限公司中华鲟研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19