本发明涉及抗体,具体涉及c肽重组兔单克隆抗体、制备方法及其应用。
背景技术:
1、c肽是胰岛素生物合成过程中,胰岛素原裂解成为胰岛素的伴随产物。c肽是由31个氨基酸(aa33-63)组成的单链多肽,分子量约为3021道尔顿。c肽在构建胰岛素原分子二硫键和胰岛素双链(a链和b链)结构中发挥重要作用。
2、胰岛素原储存在胰腺细胞高尔基复合体的分泌颗粒中,由前胰岛素原裂解产生。胰岛素原裂解的过程中,胰岛素和c肽呈等量分泌并释放到外周血循环中。虽然是胰岛素的另一半,但肝脏几乎不摄取c肽,所以其半寿期长于胰岛素,约为35分钟;在外周血中c肽的浓度是胰岛素的5到10倍,而且波动的幅度也小于胰岛素。c肽通过肾脏排泄,且尿液中c肽的浓度是血清的20~50倍,尿液中的c肽分泌片断也不会发生变化,因此,c肽经常作为表征胰岛功能强弱的标准,c肽值正常,则说明机体目前胰岛细胞还能分泌足够数量的胰岛素。
3、但由于c肽分子量较小,抗体不容易识别。因此,目前传统的抗体筛选技术筛选的c肽检测抗体的特异性、灵敏度和亲和力,还不足以满足更准确的临床诊断糖尿病需求。
技术实现思路
1、有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供c肽重组兔单克隆抗体、制备方法及其应用。本发明提供了特异性强、灵敏度高、亲和力好的c肽重组兔单克隆抗体,以及该抗体的制备方法和应用。
2、本发明提供的c肽重组兔单克隆抗体,包括以下氨基酸序列:
3、(1)其重链的cdr区包含如seq id no:1、2或3所示的氨基酸序列中的至少一个,其轻链的cdr区包含如seq id no:4、5或6所示的氨基酸序列中的至少一个;或
4、(2)与(1)所示的氨基酸序列中经过氨基酸的取代、添加或缺失一个或多个,但与(1)所示氨基酸功能相同或相似的氨基酸序列;或
5、(3)与(1)或(2)所示的氨基酸序列具备至少80%同源性的氨基酸序列。
6、本发明中,所述c肽重组兔单克隆抗体中:
7、ⅰ、其重链的四个fr区其中至少一个fr区具有如seq id no:7、8、9和10所示的氨基酸序列;其轻链的四个fr其中至少一个fr区具有如seq id no:11、12、13和14所示的氨基酸序列。
8、ⅱ、与ⅰ所示的氨基酸序列中经过氨基酸的取代、添加或缺失一个或多个,但与ⅰ所示氨基酸功能相同或相似的氨基酸序列;或
9、ⅲ、与ⅰ或ⅱ所示的氨基酸序列具备至少80%同源性的氨基酸序列。
10、本发明中,所述具有至少80%同源性的序列为在原序列的基础上,经取代、添加或缺失一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列中,所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个。
11、一些实施例中,所述c肽重组兔单克隆抗体重链的三个cdr区分别具有如seq idno:1、2和3所示的氨基酸序列;
12、一些实施例中,所述c肽重组兔单克隆抗体轻链的三个cdr区分别具有如seq idno:4、5和6所示的氨基酸序列。
13、一些实施例中,所述c肽重组兔单克隆抗体重链的四个fr区分别具有如seq idno:7、8、9和10所示的氨基酸序列;
14、一些实施例中,所述c肽重组兔单克隆抗体轻链的四个fr分别具有如seq id no:11、12、13和14所示的氨基酸序列。
15、一些具体实施例中,所述c肽重组兔单克隆抗体的重链可变区包含seq id no:1、2或3所示的cdr区和seq id no:7、8、9和10所示的fr区。
16、本发明实施例中,所述单克隆抗体的轻链可变区包含seq id no:4、5或6所示的cdr区和seq id no:11、12、13和14所示的fr区。
17、在一些具体实施例中,所述c肽重组兔单克隆抗体的重链可变区具有如seq idno:15所示的氨基酸序列;轻链可变区具有如seq id no:16所示的氨基酸序列。
18、本发明提供的c肽重组兔单克隆抗体还包括恒定区,所述重链的恒定区为兔的igg亚型;所述轻链的恒定区为κ1型。
19、本发明利用噬菌体展示技术筛选并获得了本发明所述的c肽重组兔单克隆抗体,该抗体的特异性强、灵敏度高、亲和力好。
20、本发明提供了生物材料,其包括以下至少一项:
21、1)、编码所述的c肽重组兔单克隆抗体的核酸;
22、2)、包含所述核酸的表达载体;
23、3)、转化或转染所述表达载体的宿主细胞;
24、4)、所述的c肽重组兔单克隆抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物;
25、5)、经化学标记或生物标记的所述的c肽重组兔单克隆抗体;
26、6)、所述经化学标记或生物标记的所述的c肽重组兔单克隆抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。
27、本发明对所编码所述抗体的核酸序列不做限定,凡能编码本发明所述抗体的核酸皆在本发明的保护范围之内。在一些具体实施例中,所述核苷酸具有与seq id no:17和seqid no:18所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的、且与seq idno:17和seq id no:18所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。更具体的,所述核酸包括:编码重链可变区的核酸具有如seq id no:17所示的核苷酸序列;编码轻链可变区的核酸具有如seq id no:18所示的核苷酸序列。
28、本发明提供了所述的c肽重组兔单克隆抗体的制备方法,其特征在于,包括:培养所述的宿主细胞,诱导所述c肽重组兔单克隆抗体的表达。
29、在一些具体实施例中,所述的表达载体为rgfc-pcmv3或rcl-pcmv3。
30、在一些具体实施例中,所述的宿主细胞选自大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞。优选的,所述的宿主细胞为哺乳动物hek293细胞。
31、所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物;所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。所述酶标记优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。所述免疫毒素优选为黄曲霉毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、pap、造草素、白树毒素或丝瓜毒素。
32、所述固相介质或半固体介质是指本发明所述的重组抗体、经标记的重组抗体能够附着至其上的任何支持物,包括但不限于硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯(pvdf)膜、ipdms芯片、微孔板、聚苯乙烯平板、微粒、微载体、凝胶等。
33、本发明所述的c肽重组兔单克隆抗体、生物材料和/或经宿主细胞表达的c肽重组兔单克隆抗体在制备检测糖尿病的试剂或试剂盒中的应用。
34、在一些具体的实施例中,所述检测糖尿病的指标为检测c肽水平。
35、本发明提供了检测试剂或检测试剂盒,其包括本发明所述的c肽重组兔单克隆抗体、所述的生物材料和/或所述宿主细胞表达的c肽重组兔单克隆抗体。
36、所述检测试剂或检测试剂盒还包括可接受的助剂、缓冲液、辅料或载体。
37、本发明还提供了双抗体夹心法检测试剂盒,其包括所述的c肽重组兔单克隆抗体,及与所述c肽重组兔单克隆抗体特异性配合的112#抗体,所述112#抗体的重链具有如seqid no:37所示的氨基酸序列,所述112#抗体的轻链具有如seq id no:38所示的氨基酸序列。。
38、实验表明,与其他抗体相比,采用所述112#抗体与所述c肽重组兔单克隆抗体对样本中c肽检测,发现所述112#抗体与所述c肽重组兔单克隆抗体的正反包被反应性均较强,能快速、灵敏的检测患者血清中c肽的浓度,检测结果与10ng/ml的胰岛素原交叉率低于0.25ng/ml,经过重复多次检测,结果证明,该双抗体夹心法检测试剂盒特异性强、准确度高,为临床诊疗提供了可靠依据。
39、在一些具体实施例中,所述112#抗体为包被抗体,所述c肽重组兔单克隆抗体为标记抗体,此时,所述双抗体夹心法检测试剂盒的检测特异性更强。
40、在一些具体实施例中,所述双抗体夹心法检测试剂盒适用于c肽的磁微粒化学发光。
41、在一些具体实施例中,所述双抗体夹心法检测试剂盒还包括包被缓冲液、洗涤液、封闭液和/或显色液。
42、本发明还提供了一种糖尿病的检测方法,其包括采用本发明的检测试剂、检测试剂盒或双抗体夹心法检测试剂盒对样本进行检测。
43、本发明利用噬菌体展示技术筛选并获得了本发明所述的c肽重组兔单克隆抗体,该抗体的特异性强、灵敏度高、亲和力好。本发明提供的抗体联合与其特异配对的抗体,采用双抗体夹心法进行样品中c肽检测,能快速、灵敏的检测患者血清中c肽的浓度,检测结果发现与10ng/ml的胰岛素原交叉率低于0.25ng/ml,该检测方法特异性强、准确度高,为临床诊疗提供了可靠依据。