一种用于DNA序列合成的方法与流程

本发明属于基因合成，具体涉及一种用于dna序列合成的方法。

背景技术：

1、基因序列合成是指将短的dna序列通过pcr、等温聚合或者连接的方法连接起来，形成长的、完整的基因序列，是合成生物学领域不可或缺的关键技术。基于连接的方法是将端部带有粘末端的两段或多段dna连接起来。粘末端可由多种方式产生，例如限制性内切酶切割、t5核酸外切酶酶切，即gibson组装等。近年来对于两端引物序列的改造和依赖于crispr体系的切割也越来越多地得到应用。但使用粘末端连接方式进行基因合成需面临一些问题，例如多酶体系共同作用、或者带有修饰的寡核苷酸链的应用所带来的成本增加；常温发挥作用的酶在自动化仪器不理想的且长时间的保存条件下活性的维持。这些问题使得基于连接的基因组装方式更适合在高难度序列、长序列组装领域有很好的应用，但是对于长度＜20k的序列组装来说，连接的组装方式其成本、稳定性和操作复杂程度决定了其并不是一个很好的工业生产方式。

2、基于pcr方法的dna合成弥补了连接合成方式的一些短板，例如：（1）反应温度高，有利于减少dna二级结构的干扰；（2）试剂体系成熟，反应各组分都预先混合到一起，操作方便；（3）taq酶活性高且不易失活，不需要严格的保存条件，有利于应用到自动化设备上；（4）短dna序列不需要特殊修饰，成本低廉。但是pcr合成方式自身也有着较为明显的缺点需要克服：（1）在pcr反应中容易产生副产物，且副产物种类较复杂；（2）反应中解为单链，相似序列或者高gc序列容易形成二级结构或错配，降低组装效率；（3）热循环条件根据序列复杂程度和长度会有相应变化，导致pcr反应条件需要经常摸索，无法固定下来，难以进行标准的批量合成。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明提供了一种用于dna序列合成的方法。该方法快速、高特异、反应条件固定，可用于自动化、高通量的dna合成。

2、为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

3、第一方面，本发明提供用于dna序列合成的方法，具体包括如下步骤：

4、s1、将待合成dna序列的5'端和3'端分别加入通用序列作为目标dna序列，根据所述通用序列设计pcr引物uf和ur；根据目标dna的序列信息设计2n个dna单链，依次编号为d-1、d-2…d-2n，n大于等于1，相邻的两条dna单链之间分别各有一段重叠序列，每条dna单链上重叠序列的总长度小于该dna单链的长度；

5、s2、合成s1所述dna单链，分别以无核酸酶水溶解，执行以下任一种方案：

6、a、将所述dna单链溶液预混，得到至少一个预混体系；

7、b、将所述dna单链溶液分组预混后进行pcr扩增，所述分组预混为d-1与d-2预混，d-3与d-4预混，以此类推，经pcr扩增后共得到n个扩增产物体系；

8、c、根据各所述重叠序列分别设计重叠区反向dna单链，共n-1个，依次编号为p-2、p-4…p-(2n-2)；将所述dna单链溶液和重叠区反向dna单链分组预混；所述分组预混包括d-1、d-2与p-2预混，d-3、d-4与p-4预混，以此类推，d-(2n-1)、d-2n与通用引物预混，共得到n个预混体系；

9、d、根据各所述重叠序列分别设计重叠区反向dna单链，共n-1个，依次编号为p-2、p-4…p-(2n-2)；将所述dna单链溶液和重叠区反向dna单链分组预混；所述分组预混包括d-1、d-2与p-2预混，d-3、d-4与p-4预混，以此类推，d-(2n-1)、d-2n与通用引物预混，共得到n个预混体系；将所述预混体系进行pcr扩增，得到n个扩增产物体系；

10、s3、利用已修饰连接序列的固定相将s2所得预混体系或扩增产物体系进行dna合成；

11、s4、用所述引物uf和ur对s3所得pcr扩增产物进行pcr扩增，得到所述目标dna的完整序列。

12、本发明提供的上述用于dna序列合成的方法在合成过程中不易产生无产物，具有高特异性；不易形成二级结构或错配，组装效率高；反应条件固定，易于进行批量合成，可用于自动化、高通量的dna合成。

13、结合第一方面，所述重叠反向互补序列为：对于相邻两条dna单链，如前一条为对应目标dna序列的第a到b号碱基，a小于b；后一条对应目标dna序列的第c到d号碱基，c小于d；且c小于b，则c到b号碱基序列为重叠区域。

14、结合第一方面，所述dna单链的长度为15~300nt。

15、结合第一方面，所述重叠反向互补序列的长度小于≤40bp。

16、结合第一方面，在一种可能的实现方式中，s2中所述pcr扩增的反应条件为：90~95℃，1~300s高温预变性；90~95℃，1~60s高温变性，50℃~68℃，10~120s退火，72℃，10~300s延伸，共进行1~20个循环；72℃，60~600s的后延伸。

17、结合第一方面，s3中所述pcr扩增的反应条件为：90~95℃，1~300s高温预变性；90~95℃，1~60s高温变性，50℃~68℃，10~120s退火，72℃，10~300s延伸，共进行1~40个循环；72℃，60~600s的后延伸。

18、结合第一方面，所述固定相为不溶于水的固体或胶体材料。固定相材料可以是以硅、玻璃、塑料、pdms、磁珠等常用固相材质，也可以是通过蒸镀、溅射方法形成的可修饰表面。固定相材料活性基团可以与带有醛基、氨基、羟基、叠氮基、炔基、羧基等常见的化学交联基团的dna单链连接。

19、结合第一方面，在一种可能的实现方式中，s1中编号为d-1、d-3…d-(2n-1)的dna单链为正向dna单链，编号为d-2、d-4…d-2n的dna单链为反向dna单链；相邻的两条dna单链5'端有一段重叠反向互补序列，即所述重叠序列；所述正向dna单链的序列从5'端到3'端与所述目标dna序列从5'端到3'端的一部分相同，所述反向dna单链的序列从3'端到5'端与所述目标dna序列从5'端到3'端的一部分互补。

20、结合第一方面，在一种可能的实现方式中，s2的a方案中所述预混的具体操作包括：将所述dna单链按编码顺序分为至少两组，每组含有连续编码的偶数个dna单链，将各组中正向dna单链和反向dna单链按照1:m的摩尔比预混，m大于等于1，分别得到各组的预混体系。

21、结合第一方面，在一种可能的实现方式中，s2的a方案中所述预混的具体操作包括：将一对相邻的3'端反向互补的正反向dna单链按照1:m的摩尔比混合，m大于等于1，形成n个预混体系；各预混体系中dna单链的浓度相等。

22、优选地，在该实现方式中，s3的具体操作包括：根据dna单链的编号顺序，将s2所得第一个预混体系加入含有固定相的pcr管中，加入pcr反应试剂进行pcr扩增，反应后吸走反应液，加入下一个预混体系和pcr反应试剂进行pcr扩增，以此类推，直至加完所有预混体系并完成pcr扩增。

23、结合第一方面，在一种可能的实现方式中，s2的b方案中所述预混的具体操作包括：将一对相邻的3'端反向互补的正反向dna单链按照1:m的摩尔比混合，m大于等于1，获得n个预混体系；各预混体系中dna单链的浓度相等。

24、优选地，在该实现方式中，s3的具体操作包括：根据dna单链的编号顺序，将s2中经pcr扩增所得第一个产物体系加入含有固定相的pcr管中，加入pcr反应试剂进行pcr扩增，反应后吸走反应液，加入下一个产物体系和pcr反应试剂进行pcr扩增，以此类推，直至加完所有产物体系并完成pcr扩增。

25、优选地，在该实现方式中，s3还可采用以下具体操作：将s2各预混体系经pcr扩增所得产物体系根据dna单链的编号顺序分为至少两组，将各组产物体系按照等摩尔dna单链的比例混合后，分别得到混合产物体系；根据dna单链的编号顺序，将第一组混合产物体系加入含有固定相的pcr管中，加入pcr反应试剂进行pcr扩增，反应后吸走反应液，加入下一组混合产物体系和pcr反应试剂进行pcr扩增，以此类推，直至加完所有混合产物体系并完成pcr扩增。

26、结合第一方面，在一种可能的实现方式中，s2的c方案和d方案中获得所述预混体系的具体操作包括：根据除最后一个反向dna单链之外的每个所述反向dna单链5'端的所述重叠反向互补序列的信息设计重叠区反向dna单链，共n-1个；合成各重叠区反向dna单链，分别以无核酸酶水溶解；将相邻的3'端反向互补的正反向dna单链以及与该正反向dna单链的重叠反向互补序列对应的重叠区反向dna单链或通用序列按照1:1:m的摩尔比混合，所述通用序列在最后一对正反向dna单链的混合体系中加入，m大于等于1，共获得n个预混体系。

27、优选地，所述重叠区反向dna单链的序列包含部分或全部对应的重叠反向互补序列。

28、优选地，当s2为c方案时，s3在一种可能的实现方式中的具体操作包括：将所述预混体系按dna单链的编号依次分为k组，k小于n，将各组的预混体系混合；根据dna单链的编号顺序，将s2所得第一组预混体系加入含有固定相的pcr管中，加入pcr反应试剂进行pcr扩增，反应后吸走反应液，加入下一组预混体系和pcr反应试剂进行pcr扩增，以此类推，直至加完所有预混体系并完成pcr扩增。

29、优选地，当s2为c方案时，s3在一种可能的实现方式中的具体操作包括：根据dna单链的编号顺序，将s2所得第一个预混体系加入含有固定相的pcr管中，加入pcr反应试剂进行pcr扩增，反应后吸走反应液，加入下一个预混体系和pcr反应试剂进行pcr扩增，以此类推，直至加完所有预混体系并完成pcr扩增。

30、优选地，当s2为d方案时，s3在一种可能的实现方式中的具体操作包括：将各预混体系经pcr扩增所得产物体系按dna单链的编号依次分为k组，k小于n，将各组的产物体系混合；根据dna单链的编号顺序，将s2所得第一组产物体系加入含有固定相的pcr管中，加入pcr反应试剂进行pcr扩增，反应后吸走反应液，加入下一组产物体系和pcr反应试剂进行pcr扩增，以此类推，直至加完所有产物体系并完成pcr扩增。

31、优选地，当s2为d方案时，s3在一种可能的实现方式中的具体操作包括：根据dna单链的编号顺序，将s2所得第一个产物体系加入含有固定相的pcr管中，加入pcr反应试剂进行pcr扩增，反应后吸走反应液，加入下一个产物体系和pcr反应试剂进行pcr扩增，以此类推，直至加完所有产物体系并完成pcr扩增。

32、结合第一方面，在一种可能的实现方式中，s1中所述dna单链均为反向dna单链。

33、优选地，在该实现方式中，s2的a方案中所述预混的具体操作包括：将dna单链按照顺序排列并分成k组，每组里至少包含一个dna单链，且k小于n；将各组中的dna单链等摩尔混合。

34、优选地，在该实现方式中，s2的a方案中所述预混的具体操作包括：将dna单链等摩尔混合。

35、第二方面，本发明提供上述用于dna序列合成的方法在合成长度＜20k的dna序列中的应用。

36、相比于现有技术，本发明的有益效果在于：（1）可实现单步合成，在pcr实验体系上基本达到理论上特异性最高的上限；（2）利用固定相进行合成，大量pcr副产物随着液相的抽离而带走，dna序列组装特异性高；（3）对于较为复杂的序列，例如高gc含量、短重复序列等，可以将dna单链独立预先反应，再加入到固定相上组装，进一步避免了多序列体系的非特异性交叉反应；（4）待合成dna短片段可以混合后直接加入到含有固定相的pcr管中反应，操作简便；（5）产物纯净，无需额外的切胶回收等繁琐的人工步骤，可以用于自动化仪器。