本发明属于基因工程，尤其是一种来源于大肠杆菌的5α-还原酶突变体、方法及其在催化5α-ad生产中的应用。
背景技术：
1、甾体5α-还原酶(5α-reductase)是一种疏水蛋白，主要作用是以甾体作为底物，在其环戊烷多氢菲母核的4，5位双键中c-5位置上发生加氢反应，形成相对应的化合物。5α-还原酶是一种还原型辅酶ii(nadph)的依赖型酶，主要是将nadph当作氢离子供体的辅助因子，催化甾体化合物发生氧化还原反应。5α-还原酶与雄激素代谢紊乱疾病相关，雄激素的生成、代谢和转化都与5α-还原酶关系密切，雄甾-4-烯-3,17二酮(ad)能经甾体5α-还原酶的催化被还原为重要的甾体药物中间体：5α-雄烯二酮(5α-ad)中间体。
2、目前，5α-ad可以通过化学合成或生物合成获得，其中化学合成法是以天然薯蓣皂素为原料，经多步化学反应得到双烯，双烯经肟化、水解、氧化等步骤生成5α-ad，存在反应途径长且复杂、副产物多、产物收率非常低等问题，并且在反应过程中需大量有机溶剂的参与，严重污染环境；不适合于工业化生产；生物合成法中静息细胞转化法的优势体现在细菌的静息细胞不再进行生长和繁殖，但仍具有各种酶系，具备氧化和发酵作用。其转化反应体系相对简单，反应条件容易控制，减少了杂菌和环境等因素干扰反应过程，催化反应高效专一，基本没有副产物生成，反应过程中不使用有机溶剂，顺应当今社会绿色发展和环保趋势，具有巨大应用潜力。
3、目前对5α-还原酶的分子改造较为传统，主要基于文献调研，但是由于同工酶结构的差异性，所选择的改造位点精准度较低，改造结果正向突变较少；且所用菌株发酵周期长，对底物表现的活性并不能满足工业化生产的要求，在一定程度上限制了其应用。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种来源于大肠杆菌的5α-还原酶突变体、方法及其在催化5α-ad生产中的应用。
2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种细菌5α-还原酶突变体，所述突变体的氨基酸序列为如seq id no.1所示的野生型5α-还原酶的氨基酸序列经以下至少任一单点突变后的突变体：
4、第29位氨基酸由a突变为m；
5、第103位氨基酸由m突变为y；
6、第166位氨基酸由i突变为m；
7、第223位氨基酸由l突变为m。
8、进一步地，所述突变体为5α-还原酶突变体a29m、5α-还原酶突变体m103y、5α-还原酶突变体i166m或者5α-还原酶突变体l223m；
9、所述5α-还原酶突变体a29m的氨基酸序列如seq id no.2所示；
10、所述5α-还原酶突变体m103y的氨基酸序列如seq id no.3所示；
11、所述5α-还原酶突变体i166m的氨基酸序列如seq id no.4所示；
12、所述5α-还原酶突变体l223m的氨基酸序列如seq id no.5所示。
13、一种编码如上所述的野生型5α-还原酶的基因序列，所述基因序列如seq id no.6所示。
14、一种包含如上所述的基因序列的基因工程菌，所述基因工程菌的制备方法为：
15、将编码野生型5α-还原酶的基因序列和表达载体连接构建携带5α-还原酶基因的重组质粒，通过重叠延伸pcr进行定点突变获得5α-还原酶突变体重组表达载体，转入到宿主细胞大肠杆菌中获得包含5α-还原酶突变体的基因工程菌。
16、进一步地，所述表达载体是大肠杆菌表达载体pet29b；
17、或者，所述大肠杆菌为bl21(de3)。
18、如上所述的基因工程菌的制备方法，具体步骤如下：
19、步骤一：将5α-还原酶基因片段与表达载体pet29b连接构建得到重组质粒pet29b-5α；
20、步骤二：以重组质粒pet29b-5α为模板，设计引物进行重叠延伸pcr，得到第29位氨基酸由丙氨酸突变为蛋氨酸的5α-还原酶突变体重组表达载体pet29b-5αa29m；第103位氨基酸由蛋氨酸突变为酪氨酸的5α-还原酶突变体重组表达载体pet29b-5αm103y；第166位氨基酸由异亮氨酸突变为蛋氨酸的5α-还原酶突变体重组表达载体pet29b-5αi166m；第233位氨基酸由亮氨酸突变为蛋氨酸的5α-还原酶突变体重组表达载体pet29b-5αl223m。
21、优选地，步骤二中引物如表1所示。
22、一种包含如上所述的5α-还原酶突变体的重组表达载体。优选地，表达载体是大肠杆菌表达载体pet29b。
23、如上所述的基因工程菌在5α-ad生产或在生物转化雄甾-4-烯-3,17二酮生成5α-ad中的应用。
24、利用如上所述的基因工程菌生产5α-ad的方法，利用所述5α-还原酶突变体的静息细胞催化制备5α-ad，按30g/l的静息细胞浓度至转化体系中，30℃，200r/min，转化12h。
25、进一步地，所述转化体系为：羟丙基β环糊精38g/l、葡萄糖500g/l、底物雄甾-4-烯-3,17二酮3g/l和10mm pbs缓冲液，ph为7.4。
26、本发明取得的优点和积极效果为：
27、1、本发明通过生物信息学手段对来源于大肠杆菌的5α-还原酶进行理性设计，对5α-还原酶进行结构预测、分子对接和虚拟突变等以确定其关键氨基酸位点，以获得具有高转化率的5α-还原酶突变体参与5α-ad的合成反应。
28、2、本发明通过生物信息学手段对5α-还原酶进行理性设计，并基于理性设计结合定点突变，发现了一系列突变后其转化性能能够发生变化的突变位点，并且经实验可得，实施例中对该系列位点进行单个位点的定点突变获得的单突变体，其转化率相较于野生型具有显著提升，当底物ad浓度为3g/l时，全细胞催化4h的时候，突变菌株bl21-pet29b-5αi166m转化ad为5α-ad转化率就已达到74.96％，相较于野生型提高了29.48％，在催化10h达到最大转化率94.61％，显著提高了转化效率；其余三个突变菌株相比野生型转化率都有不同程度的提高。因此，本发明提供的5α-还原酶突变体在工业生产5α-ad具有较大的应用潜力。
29、3、本发明5α-还原酶突变体是将seq id no.1所示的氨基酸序列的至少第29位、103位、第166位和第223位中的一个位置处进行定点突变的单突变体。本发明的5α-还原酶突变体，是基于生物信息学技术进行理性设计的结果。与seq id no.1所示序列的多肽相比，催化能力显著增强，解决了目前存在的5α-还原酶对催化活性低等问题。本发明提供的5α-还原酶突变体，在生产5α-ad以及构建5α-ad的基因工程菌中具有广阔的应用前景。
30、4、鉴于现有技术中存在的问题，例如，未解析5α-还原酶的三维结构、未解析其与底物作用机制、以及催化活性低等问题。本发明旨在提供一种细菌5α-还原酶突变体及其应用。本发明以来源于大肠杆菌的野生型5α-还原酶为改造起点，基于生物信息学理性设计进行定点突变，改变其催化性能。