一种BVDV快速检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于分子生物学病原核酸快速检测，具体为一种bvdv快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、牛病毒性腹泻（bovine viral diarrhea，bvd）是由牛病毒性腹泻病毒（bovineviral diarrhea virus，bvdv）引起的一种以腹泻为临床特征的传染病，可导致怀孕母牛的流产、死胎、畸胎或新生犊牛的持续感染，它具有高度传染性，但症状和病变较轻，发病率高而死亡率低。除了牛之外，其它的偶蹄目动物，如绵羊、山羊、野生反刍动物和猪，都可被感染。除牛以外的反刍动物不会感染粘膜病，但是会引起它们的繁殖力下降。所有年龄的动物都易感染。本病潜伏期7天～14天。在临床上分为急性、慢性结果。急性病牛主要表现为突然发病，体温升高，重度腹泻，白细胞减少，大量流涎，口腔粘膜糜烂和溃疡，可在发病后几天死亡。病母牛所产的犊牛发生下痢，在口腔、皮肤、肺和脑有坏死灶，在体温升高的同时白细胞减少。慢性病例临床症状不明显或逐渐发病，生长发育受阻，消瘦，体重逐渐下降。比较特殊的症状是鼻镜上的糜烂，糜烂可在鼻镜上连成一片，表现为间歇性腹泻、跛行，病程较长，可在发病几周或数月死亡。

2、直接或间接接触均可传播本病。主要由于摄食被病毒污染的饲料、饮水而感染，也可由于病畜咳嗽、剧烈呼吸喷出的传染性飞沫而使易感动物感染。另外通过运输工具，饲养用具或者通过自然界的某些宿生如鹿、羊、猪也可以传播本病。应用被病毒污染的其他疫苗或未经消毒的注射器，也可引起本病，带毒公牛能长期从精液中排出病毒，通过配种可传染给母牛。持续性感染的母牛可以通过胎盘传染给胎儿，可引起流产及犊牛的先天损失，也可能产下貌似正常的持续性感染的犊牛，持续性感染母牛其后裔也常是持续感染牛，形成母系持续感染家族。

3、bvdv属于黄病毒科瘟病毒属，与古典猪瘟病毒和绵羊边界病病毒关系密切，其有三种不同的基因型bvdv-1型、bvdv-2型、bvdv-3型。bvdv的三种基因型都可以引起致细胞病变和非致细胞病变（生物型）感染。通常，在牛群中传播的是非致细胞病变的生物型。bvdv-2型和bvdv-3型病毒通常是非致细胞病变病毒，引起过严重的急性感染的爆发和出血型综合症。三种基因型都可以引起常见的温和的和不明显的感染。目前，行业中急需一种在同一检测体系中实现对不同亚型bvdv核酸的快速检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种bvdv快速检测试剂盒及其检测方法，能够快速检测bvdv-1型、bvdv-2型、bvdv-3型并进行定性。以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

3、一种用于bvdv检测的引物和taqman探针，由正向引物1、反向引物1、taqman探针1、正向引物2、反向引物2、taqman探针2、正向引物3、反向引物3和taqman探针3组成；

4、所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述反向引物1的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述taqman探针1的核苷酸序列如seq id no：3所示；

5、所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no：4所示，所述反向引物2的核苷酸序列如seq id no：5所示，所述taqman探针2的核苷酸序列如seq id no：6所示；

6、所述正向引物3的核苷酸序列如seq id no：7所示，所述反向引物3的核苷酸序列如seq id no：8所示，所述taqman探针3的核苷酸序列如seq id no：9所示；

7、所述taqman探针1、taqman探针2和taqman探针3的荧光基团各不相同。

8、优选的，所述taqman探针的荧光基团选自fam、hex、rox、vic或cy5中的任意一种，所述taqman探针的猝灭基团选自mgb、bhq1、bhq2或tmara中的任意一种。

9、优选的，所述taqman探针1的荧光基团为vic、猝灭基团为bhq1，所述taqman探针2的荧光基团为fam、猝灭基团为bhq1，所述taqman探针3的荧光基团为cy5、猝灭基团为bhq2。

10、一种bvdv快速检测试剂盒，包括如前述任一的用于bvdv检测的引物和taqman探针。

11、一种bvdv快速检测方法，其为利用前述任一项的用于bvdv检测的引物和taqman探针对待测样本进行bvdv检测。

12、优选的，具体步骤为：

13、s1、提取待检测样本的rna；

14、s2、对步骤s1中提取的rna进行逆转录扩增反应，得到cdna模板；

15、s3、以步骤s2中得到的cdna模板、利用权利要求1～3任一项所述的用于bvdv检测的引物和taqman探针进行荧光pcr反应，反应条件为：95℃ 3分钟，然后95℃ 10秒，60℃ 30秒，40个循环，每个循环第二步收集荧光信号；

16、s4、通过荧光检测确定检测结果。

17、如前述的一种bvdv快速检测试剂盒在bvdv非诊断目的核酸快速检测中的应用。

18、与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：

19、本专利依靠多重荧光rt-pcr技术，通过使用不同荧光染料标记bvdv-1型、bvdv-2型、bvdv-3型特异性的探针基因序列，在同一检测体系中实现对不同亚型bvdv核酸的快速检测。

20、通过对三重荧光rt-pcr检测不同亚型bvdv病毒的特异性测试，证实本专利的方法仅能高效检出bvdv-1型、bvdv-2型、bvdv-3型病毒核酸，而包括btv、lsdv、akv、pprv、fmdv、blv、ibrv、brsv、bpiv-3、bav-3在内的十种常见牛病毒均不能检出。通过对三重荧光rt-pcr检测不同亚型bvdv病毒的敏感性测试，证实该方法的检测下限为10拷贝数/μl左右，与常规的rt-pcr技术相比，其敏感性提高了2~3个数量级。通过对三重荧光rt-pcr检测不同亚型bvdv病毒的稳定性测试，证明该方法具有良好的重复性和稳定性，未见阴性样品的非特异性扩增，方法的稳定性有助于减少大量临床疑似样本重复检测的时间，极大地提高工作效率。

21、bvdv是一种感染普遍的常见牛病毒病，其体外培养，易引起细胞病变，从而极大的影响牛血清制品产业的发展。随着生物药业产业的发展，各大生产企业、科研单位和高校对胎牛血清、新生牛血清的需求旺盛，这促使bvdv阴性血清更易获得用户的认可。牛养殖企业从种群净化入手，做好bvdv的清查；牛血清生产企业从生产环节入手，做好病毒的消杀，是控制bvdv感染，提高牛血清质量的必要手段。这其中，都离不开高效的开展bvdv的病原检测。

22、由于bvdv变异性强，bvdv-1型、bvdv-2型、bvdv-3型基因序列之间存在显著性差异。为了满足快速检测的需要，本专利使用多重荧光rt-pcr技术，建立了bvdv-1型、bvdv-2型和bvdv-3型同时检测的方法。由于bvdv病毒基因存在高度变异，仅利用一组引物和探针，无法完成这三种不同亚型bvdv的检测，本专利方法有助于全面的监测bvdv的感染情况，避免易忽视的bvdv稀有亚型对牛血清造成的污染。同时，该检测方法还能对bvdv的亚型进行判别。该特点是本专利有别于其他类似专利方法的独特之处。

23、总之，与病原分离、血清elisa和普通rt-pcr等传统检测方法相比，本专利建立的三重荧光rt-pcr检测不同亚型bvdv病毒的方法，具有特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好的特点，同时其操作简便，检测周期仅需2个小时，这可大幅度提升养殖企业和牛血清生产企业筛查bvdv工作的效率，对控制bvdv的传播，提高牛血清质量具有重要意义。该专利技术的推广应用可产生良好的经济效益和社会效益。