鉴别鹿皮成分的特征多肽及其应用的制作方法

本发明属于生物技术和检测领域，具体涉及一种鉴别鹿皮成分的特征多肽及其应用。

背景技术：

1、鹿角胶为鹿角经水煎煮、浓缩制成的固体胶，收载于《中国药典》2020年版一部，具有温补肝肾、益精养血的功能，用于肝肾不足所致的腰膝酸冷、阳痿遗精、虚劳羸瘦、崩漏下血、便血尿血、阴疽肿痛等症状。

2、近年来，胶原蛋白特征肽鉴别方法已成功用于鹿角胶等胶类的真伪鉴别，对于鹿角胶的质量控制起到了非常重要的作用，随着研究的升入，尚有一些不足需要改进，由于鹿皮的价格远低于鹿角的价格，导致极少数不法分子用鹿皮胶混充或者掺入鹿角胶中，而目前《中国药典》收载的特征肽鉴别方法无法有效区分，为进一步完善鹿角胶的质量控制方法，有必要建立一种快速鉴别鹿皮胶的方法。

3、目前《中国药典》收载的特征肽有如下：鹿角胶鉴别用特征肽为质荷比(m/z)765.4(双电荷)、阿胶(驴皮胶)鉴别用特征肽为质荷比(m/z)539.8(双电荷)、阿胶(驴皮胶)含量测定用特征肽为质荷比(m/z)469.25(双电荷)和质荷比(m/z)618.35(双电荷)、龟甲胶鉴别用特征肽为质荷比(m/z)631.3(双电荷)等。其中鹿角胶鉴别用特征肽，以质荷比(m/z)765.4(双电荷)→554.0和m/z765.4(双电荷)→733.0作为检测离子对，可以将鹿角胶与阿胶、龟甲胶等区分开来，但该特征肽段检测离子对在鹿皮胶、鹿角胶等均能检出，因此无法区别鹿皮胶掺伪鹿角胶投料使用的情况。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种鉴别鹿皮成分的特征多肽及其应用。

2、为解决上述技术问题，本发明提供一种鉴别鹿皮成分的特征多肽，该特征多肽的序列为：giagvtgar。

3、本发明所发现的特征多肽肽段存在于鹿皮胶原蛋白中，该特征多肽的质荷比为401.2(z＝2)。

4、本发明还提供了上述特征多肽在鉴别鹿皮鉴别中的应用。

5、即，本发明还提供了如下技术方案：

6、本发明还同时提供了一种用于鉴别鹿皮成分的特征多肽试剂盒，所述试剂盒中包含如上所述的特征多肽。

7、本发明还同时提供了一种利用上述特征多肽鉴别鹿皮成分的方法，包括以下步骤：

8、(1)对待测样品进行超声提取、酶解，得到酶解样品溶液；

9、(2)将酶解样品溶液和特征多肽同时通过超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用法进行检测，分析酶解样品溶液中的质谱结果与特征多肽的质谱图，当质谱图中出现特征多肽的色谱峰，且响应大于特征多肽的响应，判断待测样品中含有鹿皮成分。

10、作为本发明方法的改进，所述步骤(1)为：

11、将待测样品粉碎，取0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加1％(质量％)碳酸氢铵溶液50ml，称定重量作为起始重量，超声处理30min，再称定重量，用1％碳酸氢铵溶液补足减失的重量(即，补足重量至起始重量)，摇匀，精密量取lml至5ml量瓶中，加新制的胰蛋白酶溶液lml，加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度(即，稀释至5ml)，摇匀，37℃恒温酶解12h，过滤(0.22μm)，取续滤液作为酶解样品溶液。

12、作为本发明方法的进一步改进：取胰蛋白酶(序列分析级胰蛋白酶)，用质量浓度为1％的碳酸氢铵水溶液溶解，直至胰蛋白酶的浓度为1mg/ml。临用现配。

13、作为本发明方法的进一步改进：所述超高效液相色谱-三重四级杆质谱法中，超高效液相色谱条件为：色谱柱zorbax sb c18(2.7μm，2.1mm×100mm)；柱温：35℃；流动相：a：0.1％甲酸，b：乙腈；梯度洗脱。

14、作为本发明方法的进一步改进：所述梯度洗脱的条件为0～10min，a：95％→60％，b：5％→40％；10～15min，a：60％→5％，b：40％→95％；流速：0.3ml/min；平衡时间：3min，进样量1μl。

15、作为本发明方法的进一步改进：所述液相-三重四级杆质谱法中，质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化(esi)+模式下，进行多反应监测；离子源参数：干燥气(n2)：流速为14l·min-1；加热模块温度250℃；鞘气流速(n2)：11l·min-1；鞘气温度：3000℃；毛细管电压：4kv；碎裂电压：166v；二级质谱碰撞气：高纯n2，碰撞电压20v；选择m/z(二电荷)401.2→143.1、401.2→631.3作为检测离子对。

16、本发明的有益效果为：

17、(1)本发明提供的特征多肽及检测方法，为在鹿角胶中掺入鹿皮胶或使用鹿皮胶代替鹿角胶产品的检查提供了解决方案。

18、(2)本发明提供的特征多肽针对鹿皮成分具有优异的专属性和稳定性，特异性强，操作简便，具有良好的应用前景。

19、综上，本发明提供的特征多肽针对鹿皮成分具有优异的专属性和稳定性，特异性强，操作简单，可用于鹿皮胶鉴别、鹿角胶掺伪鹿皮胶及相关中成药的掺伪检查，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种鉴别鹿皮成分的特征多肽，其特征在于：特征多肽的序列为：giagvtgar。

2.根据权利要求1所述的特征多肽，其特征在于：所述特征多肽的质荷比为401.2。

3.一种用于鉴别鹿皮成分的特征多肽试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1所述的特征多肽。

4.一种利用权利要求1或2所述的特征多肽鉴别鹿皮成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)为：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述胰蛋白酶溶液的制备过程为：取胰蛋白酶，用质量浓度为1％的碳酸氢铵水溶液溶解，直至胰蛋白酶的浓度为1mg/ml。

7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于：所述超高效液相色谱-三重四级杆质谱法中，超高效液相色谱条件为：色谱柱zorbax sb c18；柱温：35℃；流动相：a：0.1％甲酸，b：乙腈；梯度洗脱。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述梯度洗脱的条件为0～10min，a：95％→60％，b：5％→40％；10～15min，a：60％→5％，b：40％→95％；流速：0.3ml/min；平衡时间：3min，进样量1μl。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述液相-三重四级杆质谱法中，质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化(esi)+模式下，进行多反应监测；离子源参数：干燥气(n2)：流速为14l·min-1；加热模块温度250℃；鞘气流速(n2)：11l·min-1；鞘气温度：3000℃；毛细管电压：4kv；碎裂电压：166v；二级质谱碰撞气：高纯n2，碰撞电压20v；选择m/z(二电荷)401.2→143.1、401.2→631.3作为检测离子对。

技术总结
本发明属于生物技术和检测领域，具体涉及一种鉴别鹿皮成分的特征多肽及其应用。本发明提供的鉴别鹿皮成分的特征多肽，其序列为：GIAGVTGAR。本发明还同时提供了一种利用上述特征多肽鉴别鹿皮成分的方法，包括以下步骤：(1)对待测样品进行超声提取、酶解，得到酶解样品溶液；(2)将酶解样品溶液和特征多肽同时通过超高效液相色谱‑三重四级杆质谱联用法进行检测，分析酶解样品溶液中的质谱结果与特征多肽的质谱图，当质谱图中出现特征多肽的色谱峰，且响应大于特征多肽的响应，判断待测样品中含有鹿皮成分。本发明可用于鹿皮胶鉴别、鹿角胶掺伪鹿皮胶及相关中成药的掺伪检查，具有良好的应用前景。

技术研发人员：刘宇文,伍勋,郑娟,杨直,程新梅,沈国芳,谌宇,孙岩,卢智玲,施思,邹耀华
受保护的技术使用者：杭州市食品药品检验研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1