一种缬氨酸的分离纯化方法与流程

本发明涉及生物发酵工程的，尤其是涉及一种缬氨酸的分离纯化方法。

背景技术：

1、l-缬氨酸(简称为缬氨酸)，化学名称为2-氨基-3-甲基丁酸，属于支链氨基酸，是人体必需的八种氨基酸之一；其分子式为ho2cch(nh2)ch(ch3)2。l-缬氨酸是医药和化妆品的主要原料，也是动物饲料的重要成分。因此，商业市场对l-缬氨酸在医药、调味品、化妆品、营养添加剂、饲料添加剂等方面的应用日益增加。

2、发酵法是生产l-缬氨酸的一种重要方法。由于l-缬氨酸在发酵生产过程中会同时产生很多杂质，这些杂质包括丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等，因此在l-缬氨酸的分离纯化中，均需要将这些杂质从l-缬氨酸中分离除去。

3、现有技术中使用的l-缬氨酸分离方法主要包括沉淀法、全膜法和离子交换法。(1)沉淀法是使用特定的沉淀剂与l-缬氨酸特异性结合从而形成沉淀，然后分离提取，该方法收率高、操作步骤简便，但对环境污染比较大；(2)全膜法虽然废水量少，但膜滤法只能去除大量的无机盐离子及大分子的杂蛋白，发酵液中存在的与l-缬氨酸性质相近的氨基酸无法根除，得到的l-缬氨酸杂质偏高；(3)离子交换法是将除去菌体的发酵液调节ph为酸性，并用强酸性阳离子交换树脂分离l-缬氨酸和杂质氨基酸，最后通过氨水洗脱分离出l-缬氨酸。如果需要提高l-缬氨酸的纯度，则需采用多级离子交换柱进行串联提取，这无疑将导致生产过程中生产废水量较大，且操作步骤繁琐，收率较低。

4、比如，中国专利申请cn105274182a涉及一种l-缬氨酸的生产方法，具体步骤如下：发酵法得到缬氨酸发酵液，发酵液微滤膜过滤，微滤液蒸发浓缩结晶得粗品，粗品溶解加水溶解后经过强酸离子交换树脂进行离子交换，流出液经超滤膜过滤，滤液真空浓缩结晶得产品。该方法经过强酸性离子交柱分离工艺，但有大量的酸碱废水排放。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种缬氨酸的分离纯化方法，采用特定凝胶型树脂作为固定相的色谱柱进行连续色谱分离，该凝胶型树脂只需要去离子水活化和洗脱，其操作简便在提升收率的同时也大量减少了酸碱废水的排放，减轻环保压力。

2、为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、一种缬氨酸的分离纯化方法，包括以下操作步骤：

4、发酵液陶瓷膜过滤、第一次真空浓缩、结晶，溶解、上柱、第二次真空浓缩和离心烘干；

5、其中，在上柱步骤中，所采用的色谱柱的固定相为均粒弱极性色谱树脂。

6、作为本发明技术方案的进一步描述，一种缬氨酸的分离纯化方法，具体包括以下步骤：

7、s1.发酵液陶瓷膜过滤：取发酵液，采用陶瓷膜过滤，收集微滤液；

8、s2.第一次真空浓缩：将所述步骤s1的微滤液进行蒸发浓缩，收集第一浓缩液；

9、s3.结晶：将所述步骤s2的浓缩液进行结晶，得到l-缬氨酸粗品；

10、s4.溶解：将所述步骤s3的l-缬氨酸粗品加入到去离子水中，重新溶解得到l-缬氨酸溶解液；

11、s5.上柱：将所述s4的l-缬氨酸溶解液通过凝胶型树脂色谱柱，用离子水洗脱，收集流出液；

12、s6.第二次真空浓缩：将所述步骤s5的流出液经过一遍滤纸，之后进行真空浓缩，收集第二浓缩液；

13、s7.离心烘干：将所述步骤s6的第二浓缩液进行冷却结晶，离心、烘干，得到l-缬氨酸成品。

14、作为本发明技术方案的进一步描述，在所述s5中，所述凝胶型树脂色谱柱的固定相为均粒弱极性的色谱树脂，所述色谱树脂由偶极矩很小的单体聚合制得，所述色谱树脂不带任何功能基。

15、在其中一个优选的实施例中，所述色谱树脂的孔表具有疏水性，可通过与小分子内的疏水部分进行结合，从而吸附溶液中的有机物。

16、本发明采用特定的色谱树脂进行连续色谱分离，该凝胶型树脂色谱柱的固定相为均粒弱极性色谱树脂，该色谱树脂由偶极矩很小的单体聚合制得，不带任何功能基，孔表的疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部进行结合作用，从而吸附溶液中的有机物。

17、采用该色谱树脂作为固定相，适用于极性溶剂中吸附非极性物质。缬氨酸属于非极性氨基酸，缬氨酸发酵液中的主要杂质亮氨酸、异亮氨酸属于非极性氨基酸，丙氨酸属于极性氨基酸酸。当带有杂质的缬氨酸水溶液经过该弱极性色谱树脂时，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸会被吸附在该树脂上，而丙氨酸则被水溶液带出。随后，水作为流动相进行洗脱，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸之间由于极性大小的不同，会先后出来，从而达到缬氨酸分离纯化的目的。

18、作为本发明技术方案的进一步描述，在所述s1中，所述陶瓷膜的孔径为0.05-0.2μm。

19、作为本发明技术方案的进一步描述，在所述s2中，所述第一浓缩液的含量浓度为300-400g/l。

20、作为本发明技术方案的进一步描述，在所述s4中，所述l-缬氨酸溶解液的质量浓度为4-5％。

21、作为本发明技术方案的进一步描述，在所述s5中，用离子水洗脱具体为，用去离子水洗脱后杂质，所述后杂质包括亮氨酸；再将流出液二次进柱用去离子水再次洗脱，除去前杂质，所述前杂质包括丙氨酸。

22、作为本发明技术方案的进一步描述，在所述s6中，所述滤纸的孔径为0.2-0.45μm。

23、作为本发明技术方案的进一步描述，一种缬氨酸的分离纯化方法，具体包括以下步骤：

24、s1.发酵液陶瓷膜过滤：采用发酵法生产缬氨酸，在发酵完毕后，取发酵液，采用陶瓷膜过滤，陶瓷膜的孔径为0.05μm，用水洗涤，至滤渣的l-缬氨酸含量低于1.5g/l时，收集微滤液；

25、s2.第一次真空浓缩：将所述步骤s1的微滤液进行蒸发浓缩，浓缩条件：内温为60℃、真空0.084mpa，浓缩至缬氨酸的含量为350g/l时，收集第一浓缩液；

26、s3.结晶：将所述步骤s2的第一浓缩液缓慢冷却至15℃进行结晶，于此温度下保温0.5h，离心，得到l-缬氨酸粗品；

27、s4.溶解：将所述步骤s3的l-缬氨酸粗品加入到14600l去离子水中，在80℃的水温下重新溶解，得到l-缬氨酸溶解液；

28、s5.上柱：将所述s4的l-缬氨酸溶解液通过凝胶型树脂色谱柱，用去离子水洗脱后杂质，所述后杂质包括亮氨酸；再将流出液二次进柱用去离子水再次洗脱，除去前杂质，所述前杂质包括丙氨酸，最后收集流出液；

29、s6.第二次真空浓缩：将所述步骤s5的流出液经过一遍孔径为0.45μm的滤纸，滤液加入到蒸发器中进行真空浓缩，浓缩条件：内温为60℃、真空0.085mpa，浓缩至缬氨酸的含量为250g/l时，收集第二浓缩液；

30、s7.离心烘干：将所述步骤s6的第二浓缩液冷却至15℃结晶，于此温度下保温0.5h，离心，得到l-缬氨酸湿品，将l-缬氨酸湿品进行双锥烘干，双锥烘干条件：真空-0.09mpa、腔内温度70℃、蒸汽压力0.2mpa，得到l-缬氨酸成品。

31、基于上述的技术方案，与现有技术相比，本发明取得的技术效果为：

32、(1)本发明提供的缬氨酸的分离纯化方法，药品级l-缬氨酸的提取收率在64％左右，纯度经hplc检测达到99％，达到医药级别标准；而传统工艺的l-缬氨酸提取收率在60％左右，纯度经hplc检测只有95％左右。

33、(2)本发明的缬氨酸的分离纯化方法，采用特定凝胶型树脂作为固定相的色谱柱进行连续色谱分离，该凝胶型树脂只需要去离子水活化和洗脱，其操作简便在提升收率的同时也大量减少了酸碱废水的排放，减轻环保压力。