质粒及HCV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价的方法与流程

本发明属于生物，涉及抗病毒药物筛选方法，尤其涉及一种质粒及hcv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价的方法。

背景技术：

1、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，简称gfp)，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光。野生型绿色荧光蛋白，最开始是 238个氨基酸的肽链，约 25kda。然后按一定规则，11 条β-折叠在外周围成圆柱状的栅栏；圆柱中，α-螺旋把发色团固定在几乎正中心处。发色图被围在中心，能避免偶极化的水分子、顺磁化的氧分子或者顺反异构作用与发色团，致使荧光猝灭。

2、荧光是荧光蛋白最特别的特点，而其中的发色团起着主要的作用。在 α-螺旋上的65、66、67位氨基酸——丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸经过环化、脱氢等作用后形成发色团。有意思的是，发色团形成过程是由外周栅栏上的残基催化，底物只需要氧气。这暗示绿色荧光蛋白被广泛用于不同物种的潜力：在不同物种中能独立表达成有功能的蛋白，而不需要额外的因子。发色团上的共轭 π键能吸收激发光能量，在很短的时间后，以波长更长的发射光释放能量，形成荧光。

3、基于gfp的诸多优点，譬如广谱性、稳定性、易于载体构建与检测、无毒害，gfp在细胞筛选、基因表达、细胞标记、遗传跟踪等领域被广泛应用。gfp作为一种活体报告蛋白同时它的荧光强度很高，易于活体观测和用仪器进行定量检测。gfp主要由11股β链组成的桶状结构和其中的发色团组成，而发色团通过大量氢键稳定在中间位置。其三级结构对于荧光的产生是十分重要的，蛋白质变性及分离的发色团都无法产生荧光。通常情况下，为了不破坏gfp的三级结构，均是在其n端和c端进行多种蛋白质的融合。

4、丙型肝炎病毒（hepatitis c virus，以下简称“hcv”）属于黄病毒科，丙型肝炎病毒属，是一种单股正链rna病毒，外含包膜。hcv的基因组rna由一个开放阅读框和两端的非编码序列（utr）组成。在复制的过程中首先翻译出一个约3000个氨基酸的多聚蛋白，之后该蛋白被切割为3个结构蛋白（core、e1和e2）和7个非结构蛋白（ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b和p7）。非结构蛋白和多种宿主蛋白相互作用，对病毒体的组装和病毒复制过程有重要作用。ns2和ns3为病毒的蛋白酶，其中ns2具有半胱氨酸蛋白酶活性负责ns2/ns3的切割。ns3的n端具有丝氨酸蛋白酶活性，在ns4a辅助因子的帮助下负责ns3/4a、ns4a/b、ns4b/ns5a、ns5a/b四个位点的切割，其c端具有解旋酶和三磷酸核苷酶活性。

5、目前国际上主要使用直接抗病毒药物对hcv感染进行治疗，此类药物通过抑制相关蛋白的活性来抑制hcv复制和感染，主要包括ns3/4a蛋白酶抑制剂、ns5b聚合酶抑制剂及ns5a 抑制剂。但由于hcv易突变，单独使用一种药物容易产生耐药，且会导致同一类型药物交叉耐药，因此此类药物的临床应用主要采用联合用药。国内的hcv感染患者大多选择传统的p/r疗法，该治疗方案不良反应严重且具有较低的svr获得率，因此开发此类药物迫在眉睫。

6、大多数高传染性病毒的细胞抗病毒实验需要在bsl-2+或者更高等级的实验室进行，然而这种实验室的资源相当短缺。目前，ns3/4a蛋白酶抑制剂的活性评价方法主要有三种，荧光共振能量转移法、活体荧光成像法和酶联免疫吸附法。活体荧光成像法和酶联免疫吸附法的准确性和稳定性都较高，但都不适用于大规模筛选；荧光共振能量转移法是目前应用较为广泛的高通量筛选方法，具有快捷、灵敏、可定量和重复性好等优点，但荧光剂易受小分子化合物影响而导致假阳性问题，同时，许多体外活性良好的抑制剂因为其细胞膜通透性或者特异性不好，在细胞内没有活性或活性很弱。因此，开发一种简洁、安全、高通量和可重复性的蛋白酶活性和蛋白酶抑制剂筛选及活性检测平台十分必要。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种质粒及hcv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价的方法，首先提供了可用于检测hcv蛋白酶抑制剂活性的质粒，本发明在gfp中插入hcv的ns3/4a蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的gfp报告蛋白，在上述改造后的gfp报告蛋白质粒上，克隆表达hcv的ns3/4a蛋白酶，可用于检测ns3/4a蛋白酶活性以及蛋白酶相关抑制剂活性，最终形成hcv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。本发明能有效克服上述蛋白酶抑制剂筛选及活性评价方法的缺点，同时能够避免使用hcv活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，bsl-1级实验室即可满足实验要求，是高效、准确、稳定、高通量、可重复的用于hcv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明首先提供了一种可用于检测丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂活性的质粒，所述质粒包含改造的gfp荧光蛋白的编码核苷酸序列以及丙型肝炎病毒蛋白酶的编码核苷酸序列，

4、所述的改造的gfp荧光蛋白内部包含可被丙型肝炎病毒蛋白酶裂解的蛋白酶切割序列，

5、所述可被蛋白酶裂解的蛋白酶切割序列插入于野生型gfp荧光蛋白的位置包括site1与site3，site1位于如seq id no.7所示的氨基酸序列的kq和kn之间，site3位于如seq id no.9所示的氨基酸序列的qk和ng之间，所述丙型肝炎病毒蛋白酶为ns3/4a。

6、作为本发明的一种优选方案，所述的丙型肝炎病毒蛋白酶的氨基酸序列如seq idno.5所示，所述蛋白酶切割序列包括：cut1如seq id no.1所示的氨基酸序列或者cut2如seq id no.2所示的氨基酸序列。

7、作为本发明的一种优选方案，所述的野生型gfp荧光蛋白的氨基酸序列如seq idno.10所示。

8、本发明第二方面提供了上述的质粒的构建方法，所述构建方法为通过p2a编码基因序列连接改造的gfp荧光蛋白编码核苷酸序列和丙型肝炎病毒蛋白酶ns3/4a的编码核苷酸序列，并将连接有改造的gfp荧光蛋白编码核苷酸序列和丙型肝炎病毒蛋白酶ns3/4a的编码核苷酸序列克隆到表达载体上，构建可用于检测丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂活性的质粒。

9、本发明中所述的表达载体包括pcdna3.1，pcmv，优选地，本发明的表达载体为pcdna3.1(+)。

10、本发明第三方面提供了一种检测丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂活性的方法，所述方法包括以下步骤：

11、1）将上述的质粒进行细胞转染，获得转染后的细胞；

12、2）添加丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂至上述转染后的细胞，观察是否可激发荧光产生以及检测荧光强度；

13、3）有激发荧光产生，则表示丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂起作用，反之表示丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂未起作用；检测荧光强度，荧光越亮，则表示丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂抑制效果越好，反之表示丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂抑制效果越差。

14、本发明第四方面提供了上述的质粒在检测丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂活性中的应用，可正向评价丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂的活性。

15、本发明最后提供了丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂抗病毒药物筛选与活性检测平台，采用上述的检测丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂活性的方法，通过荧光强度正向反映丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂的抑制效果以筛选有效的抗病毒药物。

16、本发明在gfp中插入hcv的ns3/4a蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的gfp报告蛋白，在上述含gfp报告蛋白质粒上，克隆表达ns3/4a蛋白酶，可用于检测ns3/4a蛋白酶活性以及蛋白酶相关抑制剂活性，最终形成hcv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。本发明能有效克服上述蛋白酶抑制剂筛选及活性评价方法的缺点，同时能够避免使用hcv活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，bsl-1级实验室即可满足实验要求，是高效、准确、稳定、高通量、可重复的用于hcv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。

17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

18、1）本发明开发了基于荧光蛋白gfp与丙型肝炎病毒蛋白酶活性的改造后的质粒系统，可用于检测hcv蛋白酶相关抑制剂活性，借助本发明的质粒系统，蛋白酶相关抑制剂的活性与荧光强度呈正相关，可以在细胞水平非常便捷、直观的判断抑制剂的活性。

19、2）本发明构建了基于上述质粒的抗病毒药物筛选平台，能有效克服蛋白酶抑制剂筛选及活性评价方法的缺点，同时能够避免使用hcv活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，bsl-1级实验室即可满足实验要求，是高效、准确、稳定、高通量、可重复的用于hcv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。