腾毒素半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用

本发明涉及检测，更具体地，本发明涉及腾毒素半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用。

背景技术：

1、腾毒素(tentoxin)是细链格菌(alternaria tenuis)产生的四环肽类毒素，能干扰叶绿体合成，破坏片层结构，抑制其光合磷酸化作用，导致植物幼苗褪绿。目前，腾毒素的检测方法较少，传统检测方法有气相色谱法(gc)、高效液相色谱法(hplc)，气相色谱和质谱联用技术(gc-ms/ms)等。仪器检测技术虽具有较好的准确性，但所需要的仪器昂贵，样品前处理复杂，且检测时间长，不能满足现场检测的要求。酶联免疫分析技术具有灵敏度高、快速、高通量等优点，被广泛应用于农药残留的检测。相比于上述现有的检测方法，基于抗原-抗体特异性分子识别的免疫检测方法，在现场检测方面具有更大优势，表现出快速、灵敏、简便等特点，并且成本低廉，对操作人员技能要求较低。免疫分析方法研发的关键在于设计出合适的腾毒素半抗原，制备出灵敏度高、特异性强的腾毒素抗体，但是现有技术中还未见有关于腾毒素半抗原、人工抗原、抗体的相关报道。因此，需制备一种针对腾毒素的特异性单克隆抗体，开发对腾毒素的灵敏、快速、简便的检测方法迫在眉睫。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了腾毒素半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和检测方法，针对检测食品中残留的腾毒素。

2、根据本发明的一个方面，提供了腾毒素半抗原，其结构如式(ⅰ)所示：

3、

4、根据本发明的另一个方面，提供了制备腾毒素半抗原的方法，包括以下步骤：

5、(1)取4-硝基-dl-苯丙氨酸、boc-l-亮氨酸n-羟基琥珀酰亚胺脂、n-甲基吗啉，用dmf溶解，室温搅拌反应，反应完成后旋干dmf，过柱纯化得到无色油状物，冰箱中冷冻转化为白色固体的中间体1，该步骤反应式如下式(ⅱ)所示：

6、

7、(2)取甘胺酸甲酯、中间体1、hbtu、二异丙基乙胺溶于二氯甲烷中，室温反应过夜后，蒸干溶剂，加水，用乙酸乙酯萃取2-3遍，将有机相合并蒸干，过柱纯化得中间体2，该步骤的反应式如下式(ⅲ)所示：

8、

9、(3)取中间体2溶于二氯甲烷，再加入三氟乙酸，室温反应1h，完成后旋干除去三氟乙酸，加水并用氢氧化钠溶液调节ph至9，用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，过柱纯化得中间体3，该步骤的反应式如下式(ⅳ)所示：

10、

11、(4)取boc-dl-丙氨酸、中间体3、hbtu、二异丙基乙胺溶于二氯甲烷中，室温反应过夜后，蒸干溶剂，然后加水，用乙酸乙酯萃取2-3遍，将有机相合并蒸干，过柱纯化得中间体4，该步骤的反应式如下式(ⅴ)所示：

12、

13、(5)取中间体4于乙醇中，加入氢氧化钠溶液，室温反应过夜，反应完成后蒸干溶剂，加入适量水，并用稀盐酸将溶液调为微酸性，乙酸乙酯萃取2-3遍，有机相干燥旋干过柱得白色固体的中间体5，该步骤的反应式如下式(ⅵ)所示：

14、

15、(6)取中间体5溶于二氯甲烷，再加入三氟乙酸，室温反应1h完成后，旋干除去三氟乙酸，加入水并用氢氧化钠调节ph至9，用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相过柱纯化得中间体6，该步骤的反应式如下式(ⅶ)所示：

16、

17、(7)取中间体6、hbtu、二异丙基乙胺溶于二氯甲烷中，室温反应过夜后，蒸干溶剂，加水，用乙酸乙酯萃取2-3遍，将有机相合并蒸干，过柱纯化得中间体7，该步骤的反应式如下式(ⅷ)所示：

18、

19、(8)取中间体7加入乙醇中，加入钯碳，常压下通氢气进行还原反应，反应完成后过滤，旋干得浅褐色的最终产物，即腾毒素半抗原，该步骤的反应式如下式(ⅸ)所示：

20、

21、在一些实施方式中，步骤(1)中4-硝基-dl-苯丙氨酸、boc-l-亮氨酸n-羟基琥珀酰亚胺脂与n-甲基吗啉的摩尔比为：1:1.1:2，步骤(2)中甘胺酸甲酯、中间体1、hbtu与二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:1.2:2，步骤(4)中boc-dl-丙氨酸、中间体3、hbtu与二异丙基乙胺的摩尔比为：1:1:1:2。

22、在一些实施方式中，步骤(5)中氢氧化钠溶液的摩尔浓度为6mol/l，所述步骤(7)中中间体6、hbtu、二异丙基乙胺的摩尔比为1:1.2:2。

23、根据本发明的再一个方面，腾毒素抗原为腾毒素半抗原与载体蛋白的偶联物，其结构式如式(ⅹ)所示，载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白中的一种，

24、

25、根据本发明的第四个方面，提供了一种用于检测腾毒素的组合物，包括腾毒素免疫用抗原和腾毒素包被用抗原，腾毒素免疫用抗原为腾毒素半抗原与乳铁蛋白的偶联物，腾毒素包被用抗原为腾毒素半抗原与牛血清蛋白的偶联物。

26、根据本发明的第五个方面，提供了腾毒素半抗原、腾毒素抗原以及一种用于检测腾毒素的组合物在腾毒素的免疫学检测中的应用。

27、根据本发明的第六个方面，提供了腾毒素抗体，腾毒素抗体是由腾毒素抗原经动物免疫制备得到，腾毒素抗体为腾毒素单克隆抗体。

28、根据本发明的第七个方面，提供了一种腾毒素的检测装置，含有腾毒素包被用抗原。

29、根据本发明的第八个方面，提供了一种食品中腾毒素残留的快速检测方法，方法为利用腾毒素免疫用抗原制备得到腾毒素抗体，与腾毒素包被用抗原联用，对食品中残留的腾毒素进行检测，方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感或免疫胶体金方法。

30、本发明的有益效果：本发明制备得到了结构式如式(i)所示腾毒素半抗原，其偶联载体蛋白得到结构式如式(b)所示得到人工抗原作为腾毒素包被用抗原；用腾毒素半抗原偶联载体蛋白得到结构式如式(a)所示的人工抗原作为腾毒素免疫用抗原，并进一步制备得到用于检测腾毒素的特异性抗体，该抗体对腾毒素具有良好的灵敏度，半抑制浓度为9.4ng/ml，线性范围为4.18ng/ml～20.63ng/ml，为建立腾毒素的免疫检测方法提供了核心试剂。本发明研发的腾毒素半抗原、人工抗原、抗体实现了快速准确检测相关样品中腾毒素的目的。

技术特征：

1.腾毒素半抗原，其特征在于，其结构如式(ⅰ)所示：

2.制备权利要求1所述的腾毒素半抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中4-硝基-dl-苯丙氨酸、boc-l-亮氨酸n-羟基琥珀酰亚胺脂与n-甲基吗啉的摩尔比为：1:1.1:2，所述步骤(2)中甘胺酸甲酯、中间体1、hbtu与二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:1.2:2，所述步骤(4)中boc-dl-丙氨酸、中间体3、hbtu与二异丙基乙胺的摩尔比为：1:1:1:2。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中氢氧化钠溶液的摩尔浓度为6mol/l，所述步骤(7)中中间体6、hbtu、二异丙基乙胺的摩尔比为1:1.2:2。

5.腾毒素抗原，其特征在于，所述腾毒素抗原为权利要求1所述的腾毒素半抗原与载体蛋白的偶联物，其结构式如式(ⅹ)所示，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白中的一种，

6.一种用于检测腾毒素的组合物，其特征在于，所述组合物包括腾毒素免疫用抗原和腾毒素包被用抗原，所述腾毒素免疫用抗原为权利要求1所述的腾毒素半抗原与乳铁蛋白的偶联物，所述腾毒素包被用抗原为权利要求1所述的腾毒素半抗原与牛血清蛋白的偶联物。

7.权利要求1所述的腾毒素半抗原、权利要求5所述的腾毒素抗原和/或权利要求6所述的组合物在腾毒素的免疫学检测中的应用。

8.腾毒素抗体，其特征在于，所述腾毒素抗体是由权利要求6所述的腾毒素免疫用抗原经动物免疫制备得到，所述腾毒素抗体为腾毒素单克隆抗体。

9.一种腾毒素的检测装置，其特征在于，所述检测装置含有权利要求6所述的腾毒素包被用抗原。

10.食品中腾毒素残留的快速检测方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求6所述的腾毒素免疫用抗原制备得到腾毒素抗体，与权利要求6所述的腾毒素包被用抗原联用，对食品中残留的腾毒素进行检测，所述方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感或免疫胶体金方法。

技术总结
本发明公开了腾毒素半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用，涉及腾毒素半抗原、抗原、抗体、胶体金层析检测装置及其制备和检测食品中腾毒素残留的应用。本发明提供由腾毒素半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及免疫实验动物后使其机体产生的特异性针对腾毒素的抗体，效价高，其IC50为9.4ng/mL，检测范围为4.18ng/mL‑20.63ng/mL。本发明利用抗原抗体的特异免疫学反应和易被识别的免疫标记放大技术，可以定性和半定量的检测食品或农产品中残留的腾毒素，具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、可实现现场快速检测等优点。

技术研发人员：姚莉,李淑红,邸维,谭嘉琪,劳芷晴,姚焕玲,卓雨萱,陈展杰
受保护的技术使用者：广东科贸职业学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15