招募配体增强抗原提呈效果的核酸分子、融合蛋白及mRNA疫苗的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及能增强抗原提呈效果的核酸分子、融合蛋白及其疫苗和应用，尤其是mrna疫苗。

背景技术：

1、mrna疫苗是一种全新的疫苗，具有通用度高、效力高、构建快、容易扩大生产等优点，具有重要的临床价值和应用前景。新兴的核酸疫苗(mrna或dna)作为应急疫苗则具有非常明显的时效性优势。事实上，利用mrna疫苗来诱导机体产生抗肿瘤免疫效应已显示出巨大的潜力，并已有多项研究成果进入了临床试验阶段。mrna肿瘤疫苗是将肿瘤抗原以mrna形式导入患者体内，通过肿瘤抗原刺激患者体内t细胞，激活患者自身特异性细胞免疫的肿瘤治疗方法。目前，mrna肿瘤疫苗尚无上市产品，但在全球已有19项临床试验注册，最快的已处于临床ⅱ期阶段。尽管如此，现有的mrna肿瘤疫苗在增强抗原提呈效率和t细胞免疫应答方面仍需优化提升，尤其是在mrna序列设计与合成、翻译效率与稳定性、抗原提呈效率、t细胞免疫应答强度等方面，以进一步提高抗肿瘤免疫治疗活性，加速临床转化。

2、mrna肿瘤疫苗主要通过抗原提呈细胞(apc)的翻译机制，将mrna翻译成目标抗原蛋白，其中一些抗原蛋白会经过蛋白酶体降解途径发生泛素化降解，从而产生大量的具有抗原表位的抗原肽。这些抗原肽通过抗原处理转运蛋白(tap)被转运到内质网(er)，并被n端氨基肽酶erap1和erap2修饰，然后负载到mhc-i类蛋白上，进一步转运到细胞表面，并被抗原特异性cd8+t细胞识别，从而将抗原表位信息提呈给cd8+t细胞。或者，分泌的抗原蛋白质可以被位于组织中或淋巴结中的专职抗原提呈细胞吸收，通过溶酶体降解途径降解成为大量的抗原肽，随后替换mhc-ii类分子抗原结合槽中的clip(mhc-ii类分子相关不变链肽)，形成稳定的抗原肽-mhc-ii复合物，然后转运到细胞膜，供cd4+t细胞识别，进而将抗原表位信息提呈给cd8+t细胞。此外，apc还能通过mhc-i途径将内化的外源性抗原提呈到细胞表面，即发生“交叉呈递”，交叉呈递过程对于mrna疫苗诱导细胞毒性t细胞(ctl)和b细胞反应至关重要。

3、为了有效地诱导适应性免疫反应，在抗原提呈细胞内(尤其是dc细胞)翻译后的抗原需要通过mhc-i类和mhc-ii类分子来进行抗原呈递。因而抗原提呈过程是影响mrna疫苗的免疫效果的一个重要因素。所有内源性蛋白都受mhc-i类抗原递呈的影响，只有一部分细胞内抗原被mhc-ii类分子提呈。然而，mhc-i类抗原的递呈过程通常并不高效，即使是对高亲和力的mhc-i类配体,也只有万分之一的抗原肽被递呈。因此，实现mhc-i类和mhc-ii类抗原的高效提呈对于mrna疫苗的开发具有重要意义。目前常见的策略包括将mhc分子与抗原共递送或者将抗原靶向mhc分子从而增强提呈效率。据报道，联合应用编码hpv-16e7的dna分子和编码异种mhc分子的dna疫苗可以增强交叉递呈机制，显著增强e7特异性免疫反应和抗肿瘤效应。

4、抗原的加工和提呈的一系列步骤都会影响提呈到细胞表面的表位/mhc复合物的量。除了利用mhc-i和mhc-ii类分子增强抗原提呈外，增加降解的具有抗原表位的抗原肽的分子数量也是增强抗原提呈的一种重要有效手段。大多数mhc-i类抗原肽一般通过蛋白酶体依赖的方式产生。增加抗原蛋白酶体依赖的降解策略已被证明可以改善抗原的mhc-i类呈递，从而增强e7特异性cd8+t细胞免疫反应，显著提高疫苗的效力。因此，靶向蛋白酶体增加抗原蛋白酶体降解可能为核酸药物开发提供一个全新途径。

技术实现思路

1、为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种用于增强抗原提呈效果的疫苗设计策略，应用于核酸、蛋白及多肽疫苗的结构序列设计及其制备，为促进疫苗的免疫效力提供一个新的途径，为新型治疗手段的研发提供新的思路。

2、本发明是基于发明人的下列发明工作而提出的：

3、以ova作为模式抗原蛋白，选择三种e3连接酶mdm2、vhl和keap1的肽类配体与之偶联，包括pmi、vhl ligand(以下简称为vhll)和keap1的结合元件(以下简称为keap1b)。同时还根据mdm2结合抑癌蛋白p53的蛋白复合体结构特征，选择了p53的螺旋残基的17-26位作为e3连接酶配体(以下简称为p53b)，并进一步验证了e3泛素酶连接酶的结合或招募配体可增强ova抗原蛋白在细胞内的蛋白酶体途径降解，提高mrna肿瘤疫苗的抑瘤作用和抗肿瘤活性。本发明的技术方案可进一步应用于其他mrna肿瘤疫苗的设计，并在多种肿瘤模型中研究证实其促进抗原递呈效能和发挥激活特异性t细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，实现高效的肿瘤免疫治疗的效果。本发明的技术方案还可进一步应用于预防性mrna疫苗的设计，以获得增强的免疫原性。

4、一方面，本发明提供一种核酸分子。

5、所述核酸分子的开放阅读框至少包含一个抗原元件，和至少一个e3配体元件，所述e3配体元件是e3泛素酶连接酶的结合或招募配体。

6、所述核酸分子中的e3泛素酶连接酶任选自vhl(von hippel-lindau)、mdm2、crbn、iaps、rnf、β-trcp、dcaf、keap1或其截短体或其延长体中的一种或多种；

7、进一步地，所述e3泛素酶连接酶选自ring型、hect型和rbr型；

8、进一步地，所述核酸分子中的e3泛素酶连接酶优选为vhl(von hippel-lindau)、mdm2、β-trcp、keap1或其截短体或其延长体中的一种或多种；

9、进一步地，所述e3泛素酶连接酶的结合或招募配体与一种或多种e3泛素酶连接酶结合。

10、进一步地，所述keap1，结合或招募配体对应的氨基酸序列是ldpetgeyl或与其同源性大于60％的序列。

11、进一步地，所述β-trcp，结合或招募配体对应的氨基酸序列是drhdsgldsm或与其同源性大于60％的序列。

12、进一步地，所述vhl，结合或招募配体对应的氨基酸序列是lap(oh)yi或alapyip中的至少一种，或与其同源性大于60％的序列。

13、进一步地，所述mdm2，结合或招募配体对应的氨基酸序列是etfsdlwkll、tsfaeywnllsp、ltfehywaqlts、tnwyanlekllr、tawyanfekllr、dwwplafeallr、cnckapetalcarrcqqh或cnckapetflcywrclqh中的一种或多种，或与其同源性大于60％的序列。

14、进一步地，上述核酸分子，所述抗原元件与e3配体元件是以e3配体元件-抗原元件、抗原元件-e3配体元件、e3配体元件-抗原元件-e3配体元件或抗原元件-e3配体元件-抗原元件中的任一形式连接。

15、进一步地，所述抗原元件与e3配体元件通过linker连接；

16、其中，所述linker的氨基酸序列为ggggs、(ggggs)3、(ggggs)6、(ggs)10或(gsg)10中一种或多种。

17、进一步地，所述抗原元件为天然的抗原蛋白、抗原多肽或其截短体。

18、进一步地，所述抗原元件包括有至少一个抗原表位；

19、进一步地，所述抗原元件包括有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个抗原表位。

20、进一步地，所述抗原表位是t细胞抗原决定簇或t细胞抗原表位。

21、所述抗原表位来源于肿瘤的抗原表位肽、自身免疫疾病的抗原表位肽或病原微生物的抗原表位肽。

22、所述肿瘤的抗原或抗原表位肽任选自由基因突变引起的抗原，和/或组织特异性分化抗原，和/或过表达抗原，和/或癌-睾丸抗原，和/或通用抗原，和/或致癌病毒源性抗原；

23、进一步地，所述基因突变引起的抗原任选自p53、ras、β-catenin、cdk4、cdc27、αactinin-4中的一种或多种；

24、进一步地，所述组织特异性分化抗原任选自tyrosinase、trp1/gp75、trp2、gp100、melan-a/mart1、gangliosides、psma中的一种或多种；

25、进一步地，所述过表达抗原任选自her2、wt1、epha3、egfr、cd20中的一种或多种；

26、进一步地，所述癌-睾丸抗原任选自mage、bage、gage、ny-eso-1中的一种或多种；

27、进一步地，所述通用抗原任选自telomerase、survivin中的一种或多种；

28、进一步地，所述致癌病毒源性抗原任选自ebv、hpv、hbv、人疱疹病毒、默克尔细胞多瘤病毒中的一种或多种。

29、在一种具体地实施方式中，所述核酸分子进一步包含信号肽编码区。

30、进一步地，所述核酸分子进一步包含启动子、5’端非翻译区、3’端非翻译区和polya。

31、所述启动子为t7或sp6启动子。

32、进一步地，所述核酸分子，核酸选自dna、aso、sirna、mirna、mrna、适配体中至少一种；

33、进一步地，所述核酸分子，核酸为mrna。

34、另一方面，本发明提供一种核酸疫苗。所述核酸疫苗包含上述核酸分子，以及任选地药学上可接受的辅料或者辅助性成分。

35、进一步地，所述核酸疫苗为mrna疫苗，其中，所述辅助性成分为运载所述mrna的纳米载体；所述辅料选自注射剂缓冲介质、冻干或冷冻保护剂中的至少之一。

36、进一步地，所述纳米载体选自脂质体、纳米粒、微球和脂质纳米载体中的至少之一。

37、进一步地，所述纳米载体是采用以下至少一种脂质材料制备而成：

38、dotap、dotma、dotim、dda、dc-chol、ccs、dic14-脒、dotpa、dospa、dtab、ttab、ctab、dori、dorie及其衍生物、dprie、dsrie、dmrie、dogs、dosc、lpll、dodma、ddab、dlin-mc3-dma、ckk-e12、c12-200、dspc、dmg-peg、dope、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱与胆固醇。

39、进一步地，所述mrna疫苗，脂质材料与mrna的质量比为(0.5～50)∶1，优选为(2～10)∶1。

40、进一步地，所述mrna疫苗，采用微流控设备将所述mrna和脂质材料自组装形成；

41、或者

42、所述mrna疫苗，通过所述纳米载体与mrna进行孵育形成的。

43、另一方面，本发明提供上述核酸疫苗的制备方法。

44、再一方面，本发明提供一种蛋白；所述蛋白由上述任一项所述核酸分子编码形成的。

45、再一方面，本发明提供一种蛋白或多肽疫苗；其中，上述蛋白作为抗原成分。

46、进一步地，所述蛋白或多肽疫苗还包括药学上可接受的辅料或者辅助性成分；所述辅料或者辅助性成分如上述任一项所述核酸分子中所述定义；

47、进一步地，所述蛋白或多肽疫苗还包含免疫佐剂。

48、进一步地，所述免疫佐剂选自弗氏不完全佐剂、完全弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、乳佐剂、脂质体佐剂和微生物佐剂中的一种或多种。

49、再一方面，本发明提供一种载体。携带上述所述核酸分子。

50、进一步地，所述载体为真核载体或原核载体。

51、进一步地，所述载体包括选自质粒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体中的一种或多种。

52、再一方面，本发明提供一种载体疫苗，包括活性成分；所述活性成分是通过将上述所述核酸分子装载到上述载体得到的。

53、再一方面，本发明提供一种药物组合物，包括上述核酸分子、上述核酸疫苗、依据上述的方法制备的mrna疫苗、上述的蛋白、上述的蛋白或多肽疫苗或上述的载体疫苗，以及包括药学上可接受的辅料。

54、再一方面，本发明提供上述核酸分子、上述核酸疫苗、上述方法制备的mrna疫苗、上述蛋白、上述蛋白或多肽疫苗或上述载体疫苗、上述药物组合物在制备预防或治疗相关疾病中药物中的用途。

55、进一步地，所述疾病为肿瘤。

56、本发明的有益效果在于：

57、本发明提供了一种用于增强抗原提呈效果的疫苗设计方法，可应用于核酸、蛋白及多肽疫苗的序列设计及其制备。

58、本发明将目标抗原与具有e3泛素连接酶结合和招募功能的多肽或蛋白结构域等配体共同编码于同一核酸序列中，使得核酸分子进入细胞后实现抗原蛋白与e3泛素连接酶配体的融合表达，进而促进抗原蛋白通过蛋白酶体途径的降解，增加具有抗原表位的抗原肽的数量与丰度，形成更多的肽-mhc(p-mhc)复合物，进而被提呈到细胞表面，增强后续免疫反应，发挥高效的肿瘤免疫治疗作用。

59、本发明的蛋白或多肽或核酸分子编码的蛋白或多肽，其在细胞中的抗原提呈过程依赖于泛素-蛋白酶体的蛋白降解途径，选择不同e3连接酶配体序列进行修饰构建，筛选e3泛素连接酶配体，高效招募e3连接酶，从而实现本发明蛋白或多肽的泛素化标记与蛋白降解，进而提高疫苗免疫原的抗原提呈。因此，本发明提供的蛋白或多肽或核酸疫苗具有高效的抗原提呈作用，具有较强的免疫原性，临床应用前景良好。