一种人ISG15报告基因稳转细胞株及其构建方法和应用与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种人isg15报告基因稳转细胞株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、干扰素（interferon, ifn）属于ⅱ类细胞因子家族的一部分，该家族除ifns之外，还包括il-10相关细胞因子(il-10，il-19，il-20，il-22，il-24和il-26)。基于序列同源性被分为三大类：ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型。在人类中，ifn-ⅰ家族由ifn-α(含13个亚型)、ifn-β、ifn-δ、ifn-ε、ifn-κ、ifn-τ和ifn-ω1-3组成。ifn-ⅱ仅含ifn-γ一个成员，2003年首次从人类基因组序列中鉴定出ifn-ⅲ (也被称为ifn-λ)家族，由ifn-λ1（il-29）、ifn-λ2（il-28a）、ifn-λ3（il-28b）和ifn-λ4组成。ifn-ⅰ基因位于人类9号染色体，仅含1个外显子；而ifn-ⅲ基因位于人类19号染色体，与其他il-10家族细胞因子共享5个保守的外显子，但在ifn-λ2和ifn-λ3基因中含额外的第6个外显子。对人类氨基酸序列比对发现，ifn-ⅲ与il-10和ifn-ⅰ的序列同源性较低，其中，与il-10的氨基酸同源性11%–13%；与ifn-α和il-22的氨基酸同源性是15%-19%。在人类4种ifn-ⅲ中，ifn-λ2和ifn-λ3氨基酸同源性最高为96%，而ifn-λ1和ifn-λ2的氨基酸同源性为81%，ifn-λ4与以上3种ifn-ⅲ的氨基酸同源性较低，仅具有29%同源性。

2、ifn-ⅰ和ifn-ⅲ均通过结合受体而诱导下游信号传导。所有ifn-ⅰ通过共有的异二聚体受体ifnar (interferon-alpha/beta receptor subunit，ifnar)激发信号，其中，ifnar由ifnar1和ifnar2亚基组成。ifn-ⅰ以高亲和力结合ifnar2，然后募集低亲和力的ifnar1，产生具有信号传导能力的ifnar1-ifn-ⅰ-ifnar2复合物。ifn-ⅲ用于信号传导的异二聚体受体不同于ifn-ⅰ，由ifnlr1(interferon lambda receptor 1，ifnlr1)链和il-10r2链组成。其中，ifn-ⅲ和其他il-10家族细胞因子共享il-10r2链，该链是所有il-10家族异二聚体受体的一部分。ifn-ⅲ与ifnlr1和il10r2以1︰1︰1的化学计量比结合，而il-10与il10r1和il10r2的结合比值为2︰1︰1。ifn-ⅲ以高亲和力结合ifnlr1，然后募集低亲和力的il-10r2，产生具有信号传导能力的ifnlr1-ifn-ⅲ-il-10r2复合物。

3、ifn-ⅰ受体ifnar广泛分布于各细胞表面，可产生全身性保护作用。不同于ifn-ⅰ，ifn-ⅲ受体中，虽然il-10r2链几乎存在于所有细胞表面，但ifnlr1链仅在特定组织或细胞中表达，由于单独的链无受体活性，只有两条链同时存在才能发挥受体作用，使得ifnlr的分布具有组织或细胞特异性。ifn-ⅲ受体主要分布于上皮来源的细胞，包括呼吸道、肠道和生殖道上皮细胞、肺细胞、肝细胞和角质形成细胞等。ifn-ⅲ在上皮屏障(如皮肤、胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道)以及组织屏障(如血脑屏障和胎盘屏障)上的作用尤为明显，表明它有助于上皮表面的特异性免疫反应。由于上皮表面会经常接触共生微生物和致病微生物，因此ifn-ⅲ在不激活全身性促炎反应的情况下，可在关键的屏障处提供更有针对性的保护。

4、干扰素具有广谱抗病毒活性，几乎对所有病毒都有一定程度的抑制作用。干扰素已经在临床上广泛应用于多种病毒感染性疾病的治疗。ifn-α是发现最早的治疗用生物制品之一，也是迄今为止临床应用最广泛的干扰素类型。ifn-α目前已有3个亚型被批准为上市药品，分别为ifn-α1b、ifn-α2a和ifn-α2b，均为基因重组表达产品。ifn-α具有广谱的抗病毒作用，已在临床上应用于多种病毒感染性疾病的治疗，如病毒性肝炎、成人及儿童病毒性肺炎、带状疱疹、尖锐湿疣、流行性出血热等。此外，ifn-α也可应用于包括慢性粒细胞白血病、黑色素瘤、淋巴瘤等抗肿瘤治疗。新型冠状病毒感染疫情后，干扰素一直是研究抗sars-cov-2药物的热门方向之一。2020年eiger公司开展了pegifnλ-1a治疗covid-19的临床研究。在2022年公布的聚乙二醇干扰素λ治疗covid-19的ⅲ期临床试验（nct04967430）进展中，在首次出现症状7天内接受单剂量聚乙二醇干扰素λ注射的新型冠状病毒感染患者中，与安慰剂组相比，治疗组的新型冠状病毒感染相关住院或急诊风险降低了50%（主要终点）。值得注意的是，当症状出现3天内使用聚乙二醇干扰素λ治疗，观察到更高的获益，住院或死亡率降低60%。

5、干扰素不能直接灭活病毒，而是通过旁分泌或自分泌途径诱导靶细胞内一系列干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes, isgs）的表达来发挥抗病毒作用，例如冠状病毒，是一种单链rna病毒，当冠状病毒入侵机体并进入机体细胞后，被固有免疫系统中的模式识别受体识别后，诱导其分泌干扰素的表达。干扰素以自分泌及旁分泌形式作用于靶细胞，与靶细胞表面受体结合后，激活jak1和酪氨酸激酶tyk2，进而使stat1和stat2磷酸化，并形成异源二聚体，与irf9结合形成干扰素刺激基因因子3（ifn-stimulated genefactor 3，isgf3）。isgf3转位到细胞核并与ifn刺激反应原件isres结合，触发多种具有抗病毒功能的干扰素刺激基因（(interferon-stimulated genes，isgs）的表达，产生抗病毒的效应，因此，只要检测isgs的启动子活性就可以直接反映干扰素的生物学活性。

6、目前常用的检测干扰素有效性和生物学活性的体外测定方法为病毒复制抑制法或者rt-pcr测定isg基因表达，前者容易产生较大误差，重复性不好，准确性低，后者操作复杂，耗时较长。此外，大部分的研究集中ⅰ型干扰素，如专利cn201810641969、cn112159834a和cn106546747a等（rees, phyllis a, and r joel lowy. “measuring type iinterferon using reporter gene assays based on readily available cell lines.”journal of immunological methods vol. 461 (2018): 63-72.），对人ⅲ型干扰素尤其是ifn-λ1（il-29）生物学活性和有效性方法研究较少，同时，由于ifn-ⅲ和ifn-ⅰ的序列同源性较低，且仅在特定组织或细胞中表达，适用于ifn-ⅰ生物学活性和有效性检测的方法可能并不ifn-ⅲ。荧光素酶报告基因系统已被广泛应用于研究目的基因的转录和调控，常用作标记所要研究的目标基因，使得报告基因的表达水平与目标基因的表达水平相一致，从而通过对报告基因的表达来观察目标基因的表达调控。报告基因法相对于病毒复制抑制法和rt-pcr法，实验周期短、变异性小，操作简单。因此，构建一种isg报告基因质粒和稳转细胞株，并基于稳转细胞株开发用于可同时评价ifn-ⅲ和ifn-ⅰ干扰素生物学活性和有效性的方法，对于干扰素药物开发并将其应用于抗病毒的治疗具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种人isg15报告基因稳转细胞株、构建所述稳转细胞株的方法以及所述细胞株的应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供了一种人isg15报告基因稳转细胞株的构建方法，所述方法包括以下步骤：

4、(1) 制备人isg15报告基因质粒：将人isg15基因启动子序列插入至报告基因质粒中，从而获得人isg15基因启动子驱动报告基因表达的人isg15报告基因质粒；其中，所述的人isg15基因启动子序列如seq id no：1所示；

5、(2) 将步骤(1)中制备的所述的人isg15报告基因质粒转染至人上皮细胞中；

6、(3) 根据所述质粒中携带的抗性基因，采用合适的抗生素对转染后的细胞进行抗性筛选，从而获得人isg15报告基因稳转细胞；

7、(4) 可选地，通过有限稀释法从步骤(3)的稳转细胞中筛选获得人isg15报告基因稳转单克隆细胞株。

8、在另一优选例中，所述报告基因质粒为荧光素酶报告基因质粒。

9、在另一优选例中，所述的荧光素酶报告基因质粒为pgl6-ta，将人isg15基因启动子序列插入至pgl6-ta后获得的人isg15报告基因质粒称为pgl6-isg15-luc。

10、在另一优选例中，所述荧光素酶报告基因质粒为pgl6-ta，且其中所述的人isg15基因启动子序列的插入位点为xhoⅰ和hind ⅲ双酶切位点之间。

11、在另一优选例中，所述人isg15报告基因质粒pgl6-isg15-luc具有下式i所示的表达盒：

12、e1-p-e2-luc (i)

13、其中，e1和e2各自独立地为限制性酶切位点；

14、p为人isg15基因启动子序列；

15、luc为荧光素酶基因序列。

16、在另一优选例中，所述的人上皮细胞为hnepc细胞或hela细胞，优选hnepc细胞。

17、在另一优选例中，步骤(2)中的转染为瞬时转染。

18、在另一优选例中，采用遗传霉素g418对转染了pgl6-isg15-luc后的细胞进行抗性筛选。

19、本发明的第二方面，提供了一种使用如本发明第一方面所述的方法构建的人isg15报告基因稳转细胞株。

20、在另一优选例中，所述细胞株用于：

21、(a) 干扰素生物学活性检测方法；

22、(b) 干扰素的有效性、作用机制和作用时效研究；和/或

23、(c) 可诱导isg15应答的相关药物筛选。

24、在另一优选例中，所述细胞株对ⅰ型和ⅲ型干扰素均有应答。

25、在另一优选例中，所述细胞株对ifnα-1b和ifn-λ1均有应答。

26、在另一优选例中，所述细胞株特别适合用于ifnα-1b和/或ifn-λ1的生物学活性测定。

27、本发明的第三方面，提供了如本发明的第二方面所述的人isg15报告基因稳转细胞株在选自下组的一项或多项中的应用：

28、(a) 干扰素生物学活性检测方法；

29、(b) 干扰素的有效性、作用机制和作用时效研究；

30、(c) 可诱导isg15应答的相关药物筛选。

31、在另一优选例中，所述干扰素包括ⅰ型和ⅲ型干扰素。

32、在另一优选例中，所述干扰素包括（但不限于）ifnα-1b和ifn-λ1。

33、本发明的第四方面，提供了一种检测试剂，所述检测试剂包含本发明的第二方面所述的人isg15报告基因稳转细胞株。

34、在另一优选例中，所述检测试剂用于：

35、(a) 干扰素生物学活性检测；

36、(b) 干扰素的有效性、作用机制和作用时效研究；

37、(c) 可诱导isg15应答的相关药物筛选。

38、在另一优选例中，所述干扰素包括ⅰ型和ⅲ型干扰素。

39、在另一优选例中，所述干扰素包括（但不限于）ifnα-1b和ifn-λ1。

40、本发明的第五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含：

41、(c1) 如本发明第二方面所述的人isg15报告基因稳转细胞株；

42、(c2) 报告基因检测试剂。

43、在另一优选例中，所述试剂盒还包含一说明书，所述说明书注明该试剂盒可用于：

44、(a) 干扰素生物学活性检测方法；

45、(b) 干扰素的有效性、作用机制和作用时效研究；和/或

46、(c) 可诱导isg15应答的相关药物筛选。

47、在另一优选例中，所述试剂盒为干扰素生物学活性检测试剂盒。

48、在另一优选例中，所述干扰素包括ⅰ型和ⅲ型干扰素。

49、在另一优选例中，所述干扰素包括（但不限于）ifnα-1b和ifn-λ1。

50、在另一优选例中，所述报告基因检测试剂为荧光素酶检测试剂。

51、在另一优选例中，所述荧光素酶检测试剂包括检测荧光素酶活性的检测试剂、检测荧光素酶表达水平的检测试剂。

52、本发明的第六方面，提供了一种体外干扰素生物学活性检测方法，所述方法包括使用如本发明第二方面所述的人isg15报告基因稳转细胞株进行测定。

53、在另一优选例中，所述方法包括以下步骤：

54、(i) 培养如本发明第二方面所述的人isg15报告基因稳转细胞株使其完全贴壁；

55、(ii) 将待测干扰素样品与完全贴壁的细胞共同孵育12-24小时；

56、(iii) 孵育结束后，弃去培养上清，使用报告基因检测试剂测定所述细胞株中报告基因的表达或活性；其中报告基因的表达或活性即反映了待测干扰素样品中干扰素的活性。

57、在另一优选例中，所述方法还包括：在步骤(ii)中，设置空白对照组，即同时将空白对照样品与完全贴壁的细胞共同孵育12-24小时；以及在步骤(iii)中，同时测定与空白对照样品孵育结束后的细胞株中报告基因的表达或活性，其中与空白对照组相比的相对报告基因的表达或活性即反映了待测干扰素样品中干扰素的活性。

58、在另一优选例中，所述报告基因为荧光素酶。

59、在另一优选例中，所述干扰素包括ⅰ型和ⅲ型干扰素。

60、在另一优选例中，所述干扰素包括（但不限于）ifnα-1b和ifn-λ1。

61、本发明的第七方面，提供了一种体外干扰素药效学测定方法，所述方法包括使用如本发明第二方面所述的人isg15报告基因稳转细胞株进行测定。

62、在另一优选例中，所述方法包括以下步骤：

63、(i) 培养如本发明第二方面所述的人isg15报告基因稳转细胞株使其完全贴壁；

64、(ii) 将待测干扰素样品与完全贴壁的细胞共同孵育一段时间t1；

65、(iii) 孵育结束后，弃去培养上清，使用报告基因检测试剂测定所述细胞株中报告基因的表达或活性；其中报告基因的表达或活性即反映了待测干扰素样品中干扰素的药效学性质。

66、在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述t1为0.5-2小时，优选1小时。

67、在另一优选例中，在步骤(iii)中，分别在孵育结束后多个时间间隔点（例如1、6、12、24、36、48小时）测定所述细胞株中报告基因的表达或活性，从而反映待测干扰素样品中干扰素的药效作用时间。

68、在另一优选例中，所述报告基因为荧光素酶。

69、在另一优选例中，所述干扰素包括ⅰ型和ⅲ型干扰素。

70、在另一优选例中，所述干扰素包括（但不限于）ifnα-1b和ifn-λ1。

71、应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。